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猪博卡病毒(Porcine bocavirus,PBoV)属于细小病毒科、细小病毒亚科、博卡病毒属。该病毒是引起猪群腹泻、呼吸系统疾病以及断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的重要病原。该病毒自2009年被检出以后,已相继在世界各国报道。近年来,PBoV在我国的感染率日益升高,且常与其他病原混合感染,增加了疫病防控的难度。PBoV分不同的基因型,并且各基因型毒株在猪群中流行情况不一,给养猪业造成了一定的经济损失。因此,了解PBoV河北地区流行毒株的基因组结构、基因型特征,并建立相应的检测方法对疾病的流行病学调查、准确诊断、预防及动态监控具有重大意义。本研究从河北省一严重腹泻病发病猪场检测到PBoV,将其命名为PBoV/CH/HB/HD/2017株,并对该病毒展开了一系列研究:(1)为了解PBoV/CH/HB/HD/2017株的基因组结构及特点,本研究对该毒株进行了全基因组序列扩增,并分别进行了同源性分析及进化树分析。研究结果表明,PBoV/CH/HB/HD/2017株与25条参考株之间的核苷酸同源性为40.5%–99.4%,并且与中国毒株Bocavirus pig/SX/China/2010株(HQ223038)之间的核苷酸同源性最高,为99.4%,在进化树中位于同一分支。对参考株之间进行进化树分析,结果发现,26条PBoV毒株可明显的分为3个不同的基因群(PBoV G1、PBoV G2和PBoV G3),PBoV/CH/HB/HD/2017株位于PBoV G1基因群。对不同基因群的序列进行同源性分析发现,各基因群之间毒株序列相似度高,而不同群之间差异性大。另外,通过与PBoV G2和PBoV G3基因群的VP1u区域比对发现,在PBoV G1基因群中,没有发现“HDXXY”和“YXGXF"两个保守基序的出现,不同于细小病毒及其他基因群博卡病毒的结构特点。(2)本研究对PBoV相对保守的NP1基因进行扩增,并构建了重组表达质粒,以纯化的NP1蛋白作为包被抗原,通过对反应条件的优化,最终确定抗原最佳包被浓度为2μg/mL,最佳包被条件为4℃过夜包被,血清的最佳稀释度为1:60,最佳封闭液为1%BSA,酶标二抗最佳稀释浓度为1:50 000,建立了PBoV间接ELISA诊断方法。通过ROC分析90份阳性血清和82份阴性血清的OD450nm值,最终得出其临界值为0.37,此时的灵敏度为93.9%,特异性为96.7%。特异性试验结果显示,本研究建立的间接ELISA检测方法与PEDV、TGEV、PCV2、PRRSV和PPV阳性血清无交叉反应。重复性试验结果显示,间接ELISA的批内和批间重复率CV值均小于10%。以上结果表明,本研究基于PBoV NP1蛋白所建立的ELISA检测方法可作为PBoV血清学诊断及流行病学调查的一种较好的辅助工具。(3)本研究根据PBoV的NP1基因和PEDV的M基因的保守序列,分别设计了引物和探针,经优化反应条件、反应体系后,建立了能够同时检测PBoV和PEDV的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。特异性结果显示该方法与PCV2、PRV、PDCoV、PRoV和TGEV无交叉反应,灵敏性结果显示该方法对PBoV、PEDV分别可以检测到21.8拷贝/μL和31.7拷贝/μL;且重复性好,其组内、组间变异系数均小于4%。应用本方法对河北省部分地区采集的142份仔猪腹泻样品检测,结果显示,PBoV阳性率为18.3%(26/142),PEDV阳性率为62.7%(89/142),其中PBoV与PEDV共同感染率为10.6%(15/142)。该检测方法对腹泻猪群中PBoV和PEDV的准确诊断、病原监测、流行病学调查等均具有重要意义。(4)本研究根据PBoV的NP1基因和PCV2的Cap基因的保守序列,分别设计了引物和探针,经优化反应条件、反应体系后,建立了能够同时检测PBoV和PCV2的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。特异性结果显示该方法与PRV、PCV3、PEDV、TGEV、PRoV和PDCoV无交叉反应,灵敏性结果显示该方法对PBoV、PCV2分别可以检测到21.8拷贝/μL和11.7拷贝/μL;且重复性好,其组内、组间变异系数均小于5%。应用本方法对来自河北省257份表现为呼吸系统疾病及PMWS的临床样本进行检测,结果显示,PBoV阳性率为46.3%,PCV2阳性率为56.8%,PBoV与PCV2共同感染率为28.4%,结果表明在临床中PBoV与PCV2流行率较高,并且易发生混合感染。该检测方法对具有呼吸道疾病及断奶仔猪多系统衰竭综合征等症状猪群中PBoV和PCV2的准确诊断、混合感染研究及疾病的防控具有重要意义。