香菇（Lentinus edodes）是著名的药食两用菌,既味道鲜美、营养丰富,又具有多种药理活性。香菇多糖（Lentinan）是从香菇子实体中提取得到的最有效生物活性成分,作为一种典型的β-（1-3）-D-葡聚糖,它具有降血糖、降胆固醇、抗病毒、免疫调节及抗肿瘤等多种药理活性。早在1980年代香菇多糖既作为抗癌药物上市,在临床上作为免疫增强剂用于癌症的辅助治疗。然而,其抗肿瘤作用的分子机制尚不明确,在一定程度上限制了其临床应用。目前普遍认为香菇多糖仅能通过激活免疫系统发挥间接抗肿瘤作用,而不能直接杀伤肿瘤细胞;且主要表现为T淋巴细胞免疫系统依赖。然而,本课题组在前期研究中发现,香菇多糖能显著抑制多种肿瘤细胞的体外增殖,即发挥了非免疫途径的抗肿瘤作用。因此,本论文旨在探究香菇多糖是否具有非免疫途径的直接抗肿瘤作用及其内在分子机制,为拓宽香菇多糖的临床应用、充分发挥其药用价值及开发肿瘤治疗新制剂提供理论及实验基础。本论文以房县小香菇子实体为原料,沿用课题组已建立的工艺,提取、分离、纯化得到精制香菇多糖（SLNT）并通过一系列手段进行质量评价。通过体外实验探究了香菇多糖对人结肠癌HT-29细胞的非免疫途径抗肿瘤作用;并建立T细胞缺陷的HT-29荷瘤裸鼠模型及T、B、NK细胞缺陷且巨噬细胞及补体系统等受损的HT-29荷瘤联合免疫缺陷NOD/SCID小鼠模型,探讨香菇多糖能否在不同程度免疫系统缺陷的小鼠体内发挥其非免疫途径的直接抗肿瘤活性;并着重从Ⅰ型程序性死亡（细胞凋亡）及Ⅱ型程序性死亡（自噬性细胞死亡）两个角度探索了其可能的分子机制。本课题研究不仅补充了香菇多糖抗肿瘤分子机制的理论基础,且有助于其作为功能性食品及抗肿瘤临床用药的开发应用。第一部分香菇多糖SLNT的制备香菇多糖的制备沿用本课题组已建立并优化的工艺技术:采用水提醇沉法从房县小香菇子实体中提取香菇粗多糖,再经H₂O₂脱色法除去色素及部分杂质得到脱色后多糖,最后通过超滤法分离纯化得到精制香菇多糖,经冷冻干燥后为白色絮状物,性状稳定。对提取的香菇多糖进行纯度及分子量鉴定:苯酚‐硫酸法检测精制香菇多糖的糖含量约为98.54%;高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测得精制香菇多糖的重均分子量约为6.23×10⁵ Da,且分子量均一;紫外扫描结果显示其几乎不含蛋白质和核酸。本部分实验结果表明,香菇多糖的提取工艺成熟可靠、易于控制、结果稳定;提取得到的精制香菇多糖（SLNT）分子量均一、纯度高、几乎不含其它杂质,满足后续实验要求。第二部分香菇多糖对人HT-29结肠癌体内外的非免疫途径抗肿瘤作用研究结肠癌是全球癌症致死数量排名第二的癌症,每年约有100多万新增病例和约50多万死亡病例。目前临床上主要通过手术切除病灶并通过化学疗法进行治疗。尽管化学治疗有助于缓解症状、延长病患的生命,但是其不可避免的副作用（如腹泻、恶心、呕吐、急性心肌梗死、脑血管伤害等）极大地降低了病患的生活质量,严重的甚至可能威胁生命。因此,寻找筛选具有低毒、高效抗肿瘤活性的天然产物变得十分重要。本论文选用了来源为人结肠癌原发灶、属于TNMⅠ期结肠癌、在裸鼠及NOD/SCID小鼠体内成瘤性极好、且多种癌基因表达呈阳性的人结肠癌HT-29细胞系作为研究载体,探究了天然产物香菇多糖对人HT-29结肠癌体内外的非免疫途径直接抗肿瘤作用。通过MTT比色法考察了香菇多糖（SLNT）对人结肠癌HT-29细胞体外增殖的抑制作用。结果显示,将不同浓度香菇多糖（12.5-1600μg/mL）与HT-29细胞共培养48小时后,HT-29细胞的增殖均被显著抑制,且随着香菇多糖浓度增加,抑制率增加,具有一定剂量依赖性。当香菇多糖浓度为1600μg/mL时,抑制率达到66.84%,抗肿瘤作用显著,仅次于阳性对照组氟尿嘧啶（800μg/mL）的抑制率74.24%。通过光学显微镜观察细胞形态,发现香菇多糖组中大量细胞体积变小、贴壁不紧密、与周围细胞连接消失、细胞质浓缩;而正常细胞贴壁紧密,成团生长,细胞质未出现浓缩。建立T淋巴细胞缺陷的HT-29荷瘤裸鼠模型,探究香菇多糖是否能发挥T淋巴细胞免疫系统非依赖的抗肿瘤作用。采用皮下注射HT-29细胞植瘤建立荷瘤裸鼠模型,并随机分为阴性对照组（NC,注射等体积生理盐水）,阳性对照组（5-FU,20 mg/kg氟尿嘧啶）,香菇多糖低、中、高剂量组（0.2、1.0、5.0 mg/kg SLNT）;每组6只,采取尾静脉注射方式,隔天给药,共给药10次,同时记录裸鼠体重及肿瘤体积大小。实验结束后,对离体肿瘤组织及脾脏称重,计算脾指数、抑瘤率,并检测裸鼠血清中IL-6及TNF-α的水平。结果显示,香菇多糖各剂量组裸鼠体重在正常范围内,而氟尿嘧啶组体重严重低于正常水平;低、中、高剂量香菇多糖对HT-29荷瘤裸鼠移植瘤的抑制率分别为17.88%、48.87%和57.90%,具有一定剂量依赖性;氟尿嘧啶的抑制率为67.23%,表明香菇多糖能发挥T淋巴细胞免疫系统非依赖的抗肿瘤作用。且与阴性对照组相比,香菇多糖各剂量对裸鼠的脾指数及血清中IL-6的水平无明显影响,没有统计学差异,表明香菇多糖未提高其他免疫系统功能;而结果又显示,香菇多糖显著增加了血清中TNF-α的水平,我们猜测香菇多糖的抗肿瘤作用可能与肿瘤坏死因子有一定关联。为了进一步排除香菇多糖免疫调节作用对其直接抗肿瘤作用的影响,我们采用了T、B、NK细胞缺陷且巨噬细胞及补体系统等受损的联合免疫缺陷NOD/SCID小鼠作为动物模型,并选用与裸鼠实验中相同的给药方式及剂量进行实验。随机分为阴性对照组（NC,注射等体积生理盐水）、香菇多糖低剂量组（1.0 mg/kg SLNT）及香菇多糖高剂量组（5.0 mg/kg SLNT）;每组5只,采取尾静脉注射,隔天给药,共给药10次,同时记录小鼠体重及肿瘤体积大小。实验结束后,计算脾指数、抑瘤率、评估香菇多糖的毒副作用,并检测NOD/SCID小鼠血清中IL-2、IL-12、IL-6、IFN-γ及TNF-α水平。结果显示,香菇多糖治疗对小鼠未产生毒副作用;香菇多糖（1 mg/kg and 5mg/kg）各剂量对HT-29荷瘤联合免疫缺陷NOD/SCID小鼠移植瘤的生长均有明显抑制作用,抑瘤率分别为45.05%和50.61%;且香菇多糖给药未刺激小鼠脾指数及其血清中IL-2、IL-12、IL-6、IFN-γ水平的上调,证明香菇多糖在免疫系统功能缺失的情况下抑制了HT-29移植瘤的生长,即发挥了其非免疫途径的直接抗肿瘤作用。而与裸鼠实验结果相似的,香菇多糖高剂量组显著上调了小鼠血清中TNF-α的水平,提示TNF-α可能参与了香菇多糖的直接抗肿瘤作用。总而言之,本部分研究证实了香菇多糖对人结肠癌HT-29细胞发挥了非免疫途径的直接抗肿瘤作用,且其抑瘤效果显著。并且通过两种免疫缺陷动物模型,证实了香菇多糖同样能在体内实验中发挥其T淋巴细胞免疫系统非依赖性的,甚至免疫系统非依赖的直接抗肿瘤作用。为后文香菇多糖非免疫途径抗肿瘤作用的分子机制研究奠定了基础。第三部分香菇多糖诱导人HT-29结肠癌细胞凋亡作用的研究由于细胞凋亡（Ⅰ型程序性死亡）被公认为是最主要的导致细胞死亡的分子机制,于是本部分我们通过多种手段及技术探究了香菇多糖是否能诱导HT-29细胞凋亡而发挥其直接抗肿瘤活性。首先,通过流式细胞仪检测发现400、800、1600μg/mL SLNT与HT-29细胞共培养48小时后,HT-29细胞的凋亡率分别达到20.26%、31.80%、48.50%,均明显高于阴性对照组（NC,7.31%）,且具有一定剂量依赖性。为了进一步验证其结果,我们通过DAPI染色法、AO/EB及Annexin V-FITC/PI双荧光染色法观察了SLNT对HT-29细胞凋亡形态学的影响。DAPI染色法可见SLNT组细胞出现不同程度的核固缩（呈致密浓染蓝色荧光）及核碎裂,可见半球状、新月牙状细胞核,呈典型凋亡细胞核形态,而NC组细胞核完整,染色均匀一致;AO/EB染色法可见SLNT组细胞核被染成绿色、黄绿色或橘红色且呈固缩状或圆珠状,细胞核碎裂,而NC组细胞核结构完整,着绿色且均匀一致;Annexin V-FITC/PI染色可见SLNT组出现绿色或红色的早期凋亡细胞及晚期凋亡细胞,且随着剂量增加,凋亡细胞增多。最后,我们检测了线粒体凋亡发生早期的标志性事件—线粒体膜电位下降。结果显示,香菇多糖显著降低了HT-29细胞线粒体膜电位。以上研究结果证明了香菇多糖能显著诱导HT-29细胞凋亡,从而发挥了其直接抗肿瘤作用。随后,我们通过对裸鼠及NOD/SCID小鼠HT-29肿瘤组织进行H&E染色,初步考察了肿瘤组织中细胞凋亡的情况。形态学观察发现SLNT组肿瘤组织中可见散布凋亡细胞（细胞体积缩小,胞质致密、核固缩或碎裂等）,且随着剂量增加,凋亡区域面积加大,而NC组细胞排列紧密,细胞核完整呈圆形和椭圆形。表明在体内实验中,香菇多糖也可能诱导了细胞凋亡而发挥其抗肿瘤作用。总而言之,本部分研究证明了香菇多糖能显著诱导HT-29细胞凋亡,从而发挥了其非免疫途径的直接抗肿瘤作用,也为下一部分的机制研究奠定了基础。第四部分香菇多糖诱导人HT-29结肠癌细胞凋亡的机制研究细胞凋亡主要由两种途径诱导:内源性途径（线粒体凋亡通路）和外源性途径（死亡受体凋亡通路）。由于上一部分结果发现香菇多糖显著降低了HT-29细胞线粒体膜电位,提示香菇多糖激活了线粒体凋亡通路。因此,我们首先通过免疫印迹实验及免疫组化实验检测了香菇多糖对HT-29细胞及肿瘤组织中线粒体凋亡通路相关蛋白的影响。结果发现,香菇多糖给药显著激活了凋亡效应酶Caspase-3及凋亡起始酶Caspase-9,并上调了胞浆中细胞色素C（Cytochrome c）的水平及Bax/Bcl-2的比值,表现为线粒体凋亡通路激活。随后,我们评估了线粒体凋亡通络上游刺激因子活性氧（ROS）的水平及其与凋亡的关系。流式细胞仪及荧光显微镜观测发现,香菇多糖显著升高了HT-29细胞中ROS的水平,且具有剂量依赖性;而经过活性氧抑制剂NAC预培养后,香菇多糖组的凋亡率由32.91±1.21%显著降低至21.49±1.62%(^***p<0.001);且抑制活性氧上升后,香菇多糖诱导的胞浆中Cytochrome c及Bax/Bcl-2比值的上调被阻断了,上述结果表明活性氧的升高有利于香菇多糖诱导HT-29细胞线粒体凋亡。但同时结果显示,与NAC组相比（6.94±0.57%）,NAC+SLNT组的凋亡率（21.49±1.62%）仍显著增高,提示香菇多糖可能同时通过死亡受体途径诱导HT-29细胞凋亡。死亡受体凋亡通路可由肿瘤坏死因子受体（TNFR1）、凋亡相关因子（Fas）等与相应配体（TNF-α、FasL等）结合而诱导,从而激活下游凋亡起始酶Caspase-8,继而活化凋亡效应酶Caspase-3,引发细胞凋亡。我们运用多种方法（免疫印迹、免疫组化、免疫荧光法）检测了HT-29细胞及肿瘤组织中死亡受体凋亡通路相关蛋白的水平。结果发现,SLNT显著激活了凋亡效应酶Caspase-8并抑制了NF-κB的活化。结合第二部分实验结果,香菇多糖明显上调了裸鼠及NOD/SCID小鼠血清中TNF-α的水平,提示香菇多糖可能通过TNF-α/TNFR1途径诱导死亡受体凋亡。因此,我们进一步检测了HT-29细胞分泌TNF-α的水平。结果显示细胞经香菇多糖刺激后,其分泌的TNF-α水平显著增高,表明表明香菇多糖有可能通过TNF-α/TNFR1途径激活了死亡受体凋亡通路。前期结果已发现SLNT激活了HT-29细胞及肿瘤组织中的Caspase-3,但为了进一步验证SLNT诱导的HT-29细胞凋亡是否通过Caspase-3激活介导,我们使用Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO进行了实验。流式细胞仪结果显示,经过Ac-DEVD-CHO预培养后,香菇多糖组的凋亡率由32.91±1.21%显著降低至15.88±1.58%(^***p<0.001),表明香菇多糖诱导的HT-29细胞凋亡极大程度上通过Caspase-3激活介导。而抑制了Caspase-3的激活后,Ac-DEVD-CHO+SLNT组的凋亡率（15.88±1.58%）仍比Ac-DEVD-CHO组（7.77±0.79%）高,提示香菇多糖较小程度上可能通过非Caspase-3激活的途径介导细胞凋亡,有待进一步探究。本部分研究证明香菇多糖同时激活了线粒体及死亡受体凋亡通路,并因此诱导了HT-29细胞及肿瘤组织的凋亡。其分子机制总结如下图:（1）内源性线粒体途径—活性氧急剧增加,线粒体膜电位下降,Bax/Bcl-2比值增大促进细胞色素C由线粒体释放入胞浆,导致凋亡起始酶Caspase-9活化从而激活凋亡效应酶Caspase-3,诱导细胞凋亡。（2）死亡受体途径—上调TNF-α水平,激活TNF-α/TNFR1通路,抑制NF-κB炎症反应,从而活化凋亡起始酶Caspase-8,激活凋亡效应酶Caspase-3,诱导细胞凋亡。第五部分香菇多糖诱导人HT-29结肠癌细胞自噬作用及初步机制研究自噬（Autophagy）即“自食（self-eating）”,是除细胞凋亡（apoptosis）即“自杀（self-killing）”以外的另一种细胞自我“毁灭”的过程。自噬性细胞死亡也被归Ⅱ型程序性死亡,也是导致细胞死亡的一种分子机制。因此,本部分我们进一步探讨了香菇多糖是否诱导HT-29细胞的自噬作用及其可能的分子机制。LC3是目前被广泛认可的自噬标志蛋白,常被用于自噬的监测。当自噬发生时,弥散性分布于细胞胞浆中的LC3-I会被修饰加工,形成LC3-II并定位于自噬体,从而指示自噬体生成。通过免疫印迹实验发现,与阴性对照组相比,香菇多糖组的HT-29细胞及肿瘤组织中LC3-II显著增加;且LC3免疫荧光实验结果显示,香菇多糖组细胞中绿色斑点（自噬体）较正常细胞明显增多,表明香菇多糖显著刺激了HT-29细胞内自噬体的形成。同时免疫印迹实验显示,香菇多糖显著刺激了自噬体形成关键蛋白Beclin 1的上调,再一次佐证了香菇多糖发挥了促进HT-29细胞自噬体形成的作用。而自噬体的增加并不一定意味着自噬作用增强,也有可能是由于自噬体与溶酶体融合受阻导致。因此,我们通过以下三个实验检测香菇多糖对HT-29细胞自噬流的影响:（1）检测自噬降解过程的标志蛋白p62,其含量降低表明自噬降解过程通畅;（2）mCherry-GFP-LC3B双荧光标记法,同时反映自噬体及自噬溶酶体的数量;（3）透射电镜观察自噬形态。上述实验结果显示,香菇多糖能促进HT-29细胞中自噬流增强,即激活了HT-29细胞自噬。通过免疫印迹实验检测细胞及肿瘤组织中自噬相关蛋白的含量,结果显示香菇多糖显著降低了p-mTOR、PI3K、p-AKT的含量,而显著增加了p-JNK及细胞中p-AMPK的含量。因此,推测香菇多糖可能通过以下途径诱导了HT-29细胞自噬:（1）抑制PI3K/Akt通路并激活了AMPK通路,共同直接或间接地抑制了下游自噬负调控蛋白mTOR的活性,激活自噬。（2）激活了JNK蛋白,促进其磷酸化Bcl-2/Bcl-X_L,使自噬关键蛋白Beclin 1与其解离,激活自噬。总而言之,本部分研究证实了香菇多糖能显著诱导HT-29细胞自噬,并对其内在的分子机制做了初步的探索,更详细全面的机制研究有待进一步探索。第六部分香菇多糖诱导人HT-29结肠癌细胞自噬对其直接抗肿瘤作用的影响自噬作用不同于凋亡作用（Ⅰ型细胞程序性死亡）,凋亡作用的最终结果是杀死细胞,而自噬作用对细胞生存的影响却具有双重性—既可保护又可杀伤肿瘤细胞。本部分研究承接第五部分,进一步探讨香菇多糖诱导的HT-29细胞自噬对其直接抗肿瘤作用的影响。我们选用了两种公认的自噬抑制剂3-甲基腺苷（3-MA）及氯喹（CQ）用于实验。MTT实验结果显示,自噬抑制剂氯喹及3-MA组对HT-29细胞的增殖基本无影响;而HT-29细胞经过CQ或3-MA预培养后,香菇多糖对HT-29细胞增殖的抑制率由56.04%（SLNT）分别显著降低至34.89%（SLNT+CQ）、37.63%（SLNT+3-MA）,表明香菇多糖诱导的自噬作用有助于其对HT-29细胞的直接抗肿瘤作用。为了进一步探究自噬激活对香菇多糖体内发挥直接抗肿瘤作用的影响,我们建立了自噬抑制的HT-29荷瘤NOD/SCID小鼠模型。采取皮下注射HT-29细胞植瘤,并随机分为阴性对照组（NC,注射等体积生理盐水）、自噬抑制剂氯喹组（5.0 mg/kg CQ）、香菇多糖组（5.0 mg/kg SLNT）、香菇多糖+氯喹组（5.0 mg/kg SLNT+5.0 mg/kg CQ）;每组5只,采取尾静脉注射,隔天给药,共给药10次,同时记录小鼠体重及肿瘤体积大小。实验结束后,对离体肿瘤组织称重,计算抑瘤率并评估氯喹用药的毒副作用。结果显示,香菇多糖组对移植瘤的抑制率为50.61%,而当其与氯喹联用时,抑瘤率显著降低（^*p<0.05）至35.23%。本部分研究证明了香菇多糖诱导的自噬作用有助于其对HT-29细胞的直接杀伤作用,即表现为自噬性细胞死亡（Ⅱ型细胞程序性死亡）。总的来讲,香菇多糖能够通过激活人结肠癌HT-29细胞凋亡及自噬性死亡,而发挥其非免疫途径的直接抗肿瘤作用。本论文的研究为香菇多糖作为新型抗肿瘤药物应用于临床提供了充足的理论依据及实验基础。