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玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA)与脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是农产品及饲料中检出率和检出量较高的两种霉菌毒素。研究表明,ZEA与DON均可造成雄性动物的生殖毒性,可引起雄性动物睾丸组织中的生殖细胞减少,降低血清中睾酮浓度,影响生育能力。因此,本试验以仔猪睾丸支持细胞为试验对象,探讨ZEA与DON对猪睾丸支持细胞的联合毒性作用并评价N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)对ZEA与DON联合毒性的缓解作用。首先采用CCK-8法,通过检测细胞活率确定最适染毒浓度与NAC浓度。以不同浓度ZEA(10μg/m L)、DON(0.2μg/m L)以及NAC(0.6 mg/m L)单一及联合作用于仔猪睾丸支持细胞24h,通过倒置显微镜、透射电镜观察细胞形态变化以及超微结构的变化;采用激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位及紧密连接蛋白的表达与分布变化;通过流式细胞仪检测细胞凋亡率、线粒体膜电位、活性氧表达水平以及细胞周期变化;通过q RT-PCR技术检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Bid、caspase-3和caspase-9 m RNA的相对表达量;通过Western-blot检测联合毒素及保护剂对睾丸支持细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Bid、caspase-3和caspase-9表达水平的影响,综合评价ZEA与DON对仔猪睾丸支持细胞的联合毒性作用以及NAC的缓解效应。试验结果显示:1.10μg/m L的ZEA即可显著降低细胞活率(P<0.05),0.2μg/m L的DON即可导致细胞活率显著下降(P<0.05),10μg/m L ZEA与0.2μg/m L DON联合可导致睾丸支持细胞活率极显著降低(P<0.01),联合毒性表现为亚加性效应。倒置显微镜观察结果显示,ZEA与DON联合可导致睾丸支持细胞生长状态明显变差,细胞皱缩,细胞间排列稀疏,悬浮及贴壁不紧的细胞增多;电镜结果表明ZEA与DON联合染毒导致细胞明显皱缩,细胞膜破损,胞质内自噬泡增多,内质网与线粒体嵴断裂,核染色质颜色加深并发生浓缩;免疫荧光结果显示,ZEA与DON可对紧密连接蛋白ZO-1的表达与分布造成显著影响,ZEA与DON单一及联合染毒均导致ZO-1蛋白的表达水平降低,联合毒性作用最显著。2.ZEA与DON可对仔猪睾丸支持细胞造成氧化损伤,扰乱细胞周期。ZEA与DON可极显著增加睾丸支持细胞ROS表达(P<0.01),显著或极显著降低SOD、CAT、GSH-Px的活性(P<0.05或P<0.01),并显著或极显著增加MDA含量的表达(P<0.05或P<0.01);ZEA与DON可导致睾丸支持细胞线粒体膜电位极显著下降(P<0.01),并扰乱细胞周期,造成G2期阻滞。3.ZEA与DON致睾丸支持细胞凋亡作用的检测结果显示,ZEA与DON可导致睾丸支持细胞凋亡率显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01),并可显著或极显著增加促凋亡相关基因Bax、Bid、Caspase-3和Caspase-9 m RNA以及促凋亡相关蛋白Bax、Bid、Caspase-3和Caspase-9的表达水平(P<0.05或P<0.01),并显著或极显著降低Bcl-2 m RNA及蛋白的表达水平(P<0.05或P<0.01)。4.用NAC、ZEA与DON对睾丸支持细胞联合培养,通过对细胞形态、超微结构、氧化与抗氧化指标,细胞周期及凋亡等指标进行检测,评价NAC对ZEA与DON联合致睾丸支持细胞损伤的保护效应。检测结果显示,NAC可显著降低ZEA与DON引起的细胞损伤与凋亡。与毒素联合组相比,NAC可明显缓解ZEA与DON对睾丸支持细胞细胞器及细胞结构造成的损伤,极显著降低ROS、MDA的表达量(P<0.01),并显著或极显著升高SOD、CAT、GSH-Px的活性(P<0.05或P<0.01);NAC可缓解ZEA与DON造成的细胞周期阻滞作用,极显著降低睾丸支持细胞的凋亡率(P<0.01),显著或极显著降低促凋亡相关基因Bax、Bid、Caspase-3和Caspase-9m RNA及促凋亡相关蛋白Bax、Bid、Caspase-3和Caspase-9的表达水平(P<0.05或P<0.01),并显著增加Bcl-2 m RNA及蛋白的表达水平(P<0.05)。综上所述,ZEA与DON联合染毒,可对睾丸支持细胞造成氧化损伤,破坏细胞器及超微结构,阻滞细胞周期,并诱导其发生凋亡,其诱导凋亡的作用途径与线粒体介导的凋亡途径有关;ZEA与DON的氧化损伤效应加剧了细胞的凋亡;NAC对ZEA与DON联合致睾丸支持细胞损伤具有较好的缓解效应,并可通过抗氧化作用降低ZEA与DON的氧化损伤效应来缓解细胞凋亡。