微生物酯酶具有高活力、优良的区域和立体选择性以及环境友好性,广泛应用于制备手性化合物的生物过程,在高附加值的药物中间体和精细化学品的生产中发挥着越来越重要的作用。其中,利用酯酶催化的立体选择性拆分反应以制备2-羟基羧酸在该领域已经受到广泛重视。一些重要的手性2-羟基羧酸,如扁桃酸,邻氯扁桃酸和2-羟基4-苯基丁酸,在药物合成和消旋体手性拆分中有着广泛应用。目前,通过开发新催化剂和新工艺制备光学纯2-羟基羧酸已经成为学术界和工业界关注的研究热点。本论文在总结有关手性扁桃酸及其衍生物的化学/酶法制备技术文献报道的基础上,分析了利用微生物酯酶对映选择性水解拆分扁桃酸酯的相关研究,首次提出了化学乙酰化扁桃酸手性中心的2-位羟基,并利用酯酶催化对映选择性水解脱除2-羟基上乙酰基的新颖拆分路径。首先通过以目标底物和反应为导向的生物催化剂筛选,从土壤微生物中获得了一株能够对映选择性催化水解目标底物乙酰基扁桃酸的细菌,初步实现了该拆分路线；随后对此菌株在摇瓶和发酵罐中的培养条件进行了优化,提高了酯酶的产量和整细胞催化剂的比活力；通过对整细胞催化剂的固定化和通透化,提高了稳定性和表观活力,同时保持了该酶促反应的高立体选择性；通过催化剂工程、底物工程和反应介质工程的研究,扩展了底物范围,加快了反应速率,提高了底物浓度。按照以上思路本论文主要分为以下几部分：第一部分,以乙酰基扁桃酸以及扁桃酸甲酯和乙酯为目标底物,以目标底物酶促水解生成手性扁桃酸为目标反应,对土壤微生物进行了广泛的筛选。通过不同的初步筛选策略和方法,得到了259株具有酯水解酶活力的菌株。在筛选中,以乙酰化扁桃酸为底物避免了土壤微生物对扁桃酸的降解,并筛选成功得到了8株具有较高对映选择性水解活力的菌株。通过复筛和复证,发现了一株能够以高活力和高对映选择性催化S-乙酰基扁桃酸水解的细菌,产物光学纯度为98.1%。经过16S rDNA鉴定,确定为假单胞菌,将其命名为Pseudomonas sp. ECU1011,保藏编号CGMCC2872。第二部分,针对摇瓶发酵产酶量不高的问题,对发酵条件进行了优化。首先采用单因素方法对培养基配方和摇瓶发酵条件进行了考察,确定了培养基的最优成分,发现添加锌离子和锰离子可以提高酶产量。通过统计学试验,发现酵母膏、氯化钠和硫酸锌对产酶影响较大并通过进一步试验得到这三种组分的最优含量。将摇瓶优化得到的结果在5升发酵罐中进行验证,表明发酵过程是高耗氧、pH敏感和可由扁桃酸诱导的。流加扁桃酸可起到pH调节剂和诱导剂的双重作用,解除了pH>7.5时对菌体生长的抑制。通过pH和DO反馈控制,实现了恒溶氧和恒pH发酵过程,在14小时内获得了4166 u/L的产酶量。第三部分,对该对映选择性脱酰基反应中用到的整细胞生物催化剂进行了固定化和通透化。考察了固定化细胞和固定化酶的制备方法,结果表明以海藻酸钙包埋的固定化细胞的活力回收为73.6%,可以重复使用12批次、150小时；硅藻土吸附的固定化粗酶的活力回收为65%；戊二醛交联对酶和细胞均存在严重的失活作用。利用表面活性剂及其它方法对整细胞进行通透处理,发现经10%甲苯处理2小时后的整细胞的催化活力提高228%。将细胞通透后固定化得到了高活力(活力回收率171%)、高稳定性(半衰期123小时)的固定化-通透化细胞催化剂,并利用该催化剂对乙酰基扁桃酸另一高附加值底物乙酰基邻氯扁桃酸进行了重复拆分。第四部分,对假单胞菌酯酶的对映选择性水解反应进行了研究。发现酶促水解反应最适温度为30℃,最佳pH为7.0。考察了其对底物的耐受性,发现60 mM是整细胞能够完成反应的最大底物浓度。对于苯环上不同位置氯取代的底物衍生物、不同酰基碳链长度的底物衍生物和乙酰化2-羟基苯丁酸,该酶均可以催化其动力学拆分反应。对底物的离去酰基基团、反应溶剂体系和底物形式进行了改造,发现在无缓冲的单水相体系中,以盐形式存在的乙酰基扁桃酸钠的脱乙酰速率提高3.75倍,底物浓度可以提高到500mM。