肝损伤后纤维化形成(Fibrosis following liver injury，FFLI)是发病率日益增加、广泛威胁着人类健康的世界范围性疾病。　　 FFLI的特征有两方面：一、以特别是I型胶原为主的细胞外基质(ECM)合成增多、降解减少，过多沉积在肝内；二、功能性肝细胞的相对体积、绝对数量明显减少，与此同时，肝星状细胞(HSC)激活。　　 研究证明，在FFLI发生机制中，HSC是ECM大量产生的主要细胞来源，是FFLI发生与发展的中心环节。肝实质细胞受损是HSC激活的始动因素；HSC多种刺激中，TGF-β1及其主导的Smads通路处于FFLI中的中心位置。　　 抗FFLI理想策略应包含三部分：(1)阻止肝内纤维合成；(2)刺激肝组织内再生细胞的分裂；(3)损伤肝组织结构的重建。　　 目前，基于对FFLI分子机制的认识，基因治疗的基本策略一般可以从以下几方面着手：第一，以TGF-β1等丝裂原为靶位点，抑制HSC的激活从而减少胶原合成；第二，以MMPs及TIMPs为靶位点，促进ECM降解；第三，抑制炎症反应，保护肝细胞。基因治疗文献总结分为：(1) HGF为靶向(2)针对MMPs及其抑制剂TIMPs(3)针对间质炎症(4) HSC为靶向治疗(5)针对uPA的方法(6)端粒酶方法(7)肝干细胞为靶向的治疗(8)以TGF-β1为靶向的基因治疗(9)针对RNA干扰技术的途径。　　 研究证明，核心蛋白聚糖(DCN)能调节胶原合成等，对防止组织纤维化的发生起重要作用；DCN能结合并灭活TGF-β1，调节其生物利用度。　　 Fusin是CXC家族成员之一，与CXCR4的生物学特性一致。在损伤肝组织中，某些趋化因子及其相应受体如基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)和CXC趋化受体-4(SDF-1α/CXCR4)间的相互作用对表达相应趋化因子和受体的外源性细胞如骨髓衍生间充质干细胞(BMdMSCs)起趋化作用。　　 BMdMSCs与HSC之间存在双向相互影响的现象。有证据显示，BMdMSCs可以抑制HSC的激活，而激活的HSC需要BMdMSCs横向分化成新的肝细胞，从而刺激内源性实质细胞的更新，增强ECM的降解。　　 如何使BMdMSCs在已具备有损伤肝细胞更新能力基础上，使之同时获得并发挥抗纤维合成的能力呢?　　 也许对其进行分子生物学干预手段的基因修饰不失为一种好的选择。　　 目前，双基因修饰BMdMSCs的文献报道较少，相关性研究的大部分集中将一个目的基因和一个报告基因如绿色荧光蛋白转入靶细胞以便追踪目的基因表达情况。采用蛋白水解及纤维连接蛋白追踪法以及转染技术将DCN及Fusin最终导入BMdMSCs，目前尚未见到同类文献报道；联合采用DCN及Fusin并通过分子干预手段修饰BMdMSCs的方式来进行FFLI联合基因治疗，目前也尚未见到同类文献报道。　　 本实验包含两部分，每部分的研究目的分述如下：　　 第一部分：Decorin/Fusin双基因修饰对BMdMSCs趋化及抗纤维合成能力的体外实验研究。目的：(1)观察通过蛋白水解及纤维连接蛋白追踪法构建携带DCN及Fusin的嵌合体融合基因慢病毒表达载体，并将其导入BMdMSCs的可行性；(2)观察修饰BMdMSCs是否能够同步、稳定表达导入的两种基因；(3)通过体外趋化动力学以及Transwell纤维合成实验，观察在特定环境下，修饰BMdMSCs体外趋化动力学以及趋化穿基质胶膜后的抗纤维合成能力。　　 第二部分：兹标记Decorin/Fusin双基因修饰BMdMSCs大鼠损伤肝内活体MRI追踪及功能评价。目的：将PLL介导的SPIO兹标记双基因修饰BMdMSCs，标记后的细胞经门静脉植入药物性FFLI大鼠体内。(1)通过MRI扫描探讨兹标记后修饰BMdMSCs大鼠肝内的分布情况；(2)通过术后纤维化量分析间接评价修饰BMdMSCs大鼠体内后的生物学特性。　　 第一部分 Decorin/Fusin双基因修饰对BMdMSCs趋化及抗纤维合成能力的体外实验研究　　 一、实验方法　　 1、BMdMSCs的分离、鉴定；　　 2、携带嵌合体融合基因重组慢病毒表达载体质粒的构建；　　 3、慢病毒小包装、病毒滴度测定及病毒转染BMdMSCs；　　 4、修饰BMdMSCs后融合基因及其相关蛋白的检测；　　 5、双基因修饰BMdMSCs的趋化动力学及趋化、穿膜后增殖变化；　　 6、Transwell体外纤维合成实验。　　 二、实验结果　　 1、BMdMSCs培养30小时后，表面抗原CD34、Thy-1、GSTπ均阳性表达。病毒滴度达1×107cfu/ml；基因转染效率抗性筛选后达30％。　　 2、经鼠anti-His抗体免疫印迹检测、流式细胞仪Simultest检测、RTPCR确定了两个目的基因mRNA水平表达，而且为同步表达。　　 3、与空载体组相比较，修饰BMdMSCs自Boyden或Transwell小室趋化动力学因下室不同处理而改变；SDF-1α处理后趋化、穿膜后贴壁活性增加，且呈剂量依赖性(p＜0.05)。　　 4、Transwell细菌胶原酶消化法结合流式细胞技术显示Ⅰ型胶原、α-SMA均明显表达，PDGF条件下的表达更显著(p＜0.05)。　　 第二部分磁标记decorin/fusin双基因修饰BMdMSCs大鼠损伤肝内活体MRI追踪及功能评价　　 一、实验方法　　 1、复合多因素肝纤维化模型的制备、术前标本留取；　　 2、体外磁标记修饰BMdMSCs的鉴定以及标记后的增殖评价；　　 3、实验分组、术前后血清、组织学检测及术后大鼠肝脏MRI扫描；　　 4、术后Ⅰ型胶相对含量和密度检测——纤维化量分析。　　 二、实验结果　　 1、模型成功率约95％、诱导时间13周、模型稳定。术中死亡率10％；13周后模型大鼠肝组织HE切片：可见小叶周边破坏严重、广泛桥架坏死、假小叶分成独立的细胞团。　　 2、Prussian blue染色结果显示，几乎每个标记的修饰BMdMSCs胞质内均有数量不等的阳性蓝染致密颗粒，未标记细胞无蓝染颗粒、呈阴性。　　 3、体外兹标记修饰BMdMSCs移植大鼠体内后，术后受试大鼠肝组织普鲁士蓝染色见聚集、呈阳性蓝染的铁颗粒细胞。　　 4、与术前相比较，兹标记双基因修饰组大鼠肝组织内随着术后时间延长，肝组织HYP含量、Ⅰ型胶原相对含量逐步降低，说明肝组织内双基因修饰BMdMSCs在肝损伤部位的归巢、生长及增殖活性持续存在。　　 三、结论　　 1、本实验首次成功构建携带DCN及Fusin的嵌合体融合基因重组慢病毒表达载体pLTR-CMV-FIB-Fusin-RKRRKR-DCN质粒，首次将DCN及Fusin导入BMdMSCs，使修饰BMdMSCs兼有双重效应的生物学行为。　　 2、本实验结果证明，DCN及Fusin双基因修饰BMdMSCs是可行的；修饰BMdMSCs可稳定、同步表达Fusin及DCN。DCN及Fusin双基因转染BMdMSC的转染效率为30％，说明重组慢病毒与BMdMSCs之间存在良好的相互作用；但所测定的转染效率和国际领先研究小组的报道(有的报道称转染效率＞90％)相比较仍有差距。　　 3、本实验首次联合使用DCN及Fusin并通过分子干预手段及转染技术修饰BMdMSCs。通过体外实验证实，Fusin/Decorin双基因修饰BMdMSCs既表现有强的趋化能力，也表现有抗纤维合成能力。　　 4、Transwell纤维合成实验结果表明，在不同微环境下，双基因修饰BMdMSCs有可能发生结构性适应性变化，能够从一个稳定的趋化因子样结构状态转变为一个纤维合成抑制剂样结构状态。　　 5、PLL介导SPIO磁标记Decorin及Fusin双基因修饰BMdMSCs植入大鼠体内后，T2*WI序列MRI扫描追踪到了其在损伤肝内产生的低信号密度区。　　 6、纤维量结果提示，磁标记修饰BMdMSCs植入大鼠体内后，对Ⅰ型、TGF-β1具有一定的下调作用；间接说明，修饰BMdMSCs体内移植后持续发挥其生物学特性；对损伤肝组织修复及结构重建的基因治疗提出新的思维。