骨关节炎是一种关节软骨的退行性疾病。诸多因素均可引起关节软骨变性和丢失,继而导致关节边缘和软骨下骨骨质再生并引发滑膜炎症。骨关节炎是常见的致残疾病,发病率高,严重威胁着人类的健康和生活。尚无有效的方式治疗骨关节炎,临床上主要通过药物治疗(口服或关节腔注射)来缓解骨关节炎的症状,但并不能从根本上修复骨关节炎的软骨损伤。目前,骨关节炎的基因治疗受到了广泛关注,其可以通过调节相关基因的表达而促进软骨修复。此外,与单一疗法相比,联合治疗的方式可以起到增强疗效的作用。因此,将基因和药物联合应用来治疗骨关节炎可为骨关节炎的治疗提供新思路。氯诺昔康是一种新型的非甾体类抗炎药,主要通过发挥抗炎镇痛作用来治疗骨关节炎。MicroRNA-140是一种小的非编码RNA,可以通过调节与骨关节炎相关基因的表达,从而促进软骨修复。将氯诺昔康和microRNA-140联合应用可达到消除炎症和修复软骨损伤的双重目的。但microRNA难入胞且容易被核酸酶降解,仍需寻求合适的microRNA递送载体来克服microRNA应用的瓶颈。金纳米粒是直径为1～100nm的金的缔合胶体,具有很多优良的性质,是常用的基因递送载体。本课题首先制备了载microRNA-140的金纳米粒复合物并对其理化性质和核酸酶稳定性进行了考察;然后对复合物的体外安全性、入胞能力和体外基因调控能力进行了表征;最后通过大鼠体内的药效学实验验证了氯诺昔康和microRNA-140联合应用(先后注射进入关节腔内)治疗骨关节炎的效果。主要研究内容及结果如下:1.AuNPs/miR-140复合物的制备、表征及核酸酶稳定性考察首先,采用聚乙烯亚胺(PEI)还原法制备金纳米粒(AuNPs),以AuNPs紫外-可见吸收的特征曲线为评价指标,通过单因素试验,筛选该法制备AuNPs的最佳条件,并对制备的AuNPs的外观性状、微观形态、粒径和Zeta电位进行表征;然后,通过静电吸附作用将microRNA-140(miR-140)连接到AuNPs上,制备载基因的金纳米粒,即AuNPs/miR-140复合物,以复合物的粒径和电位以及AuNPs压缩miR-140的能力为评价指标,确定AuNPs/miR-140复合物的最佳质量比(Au:miR-140);最后,通过比较AuNPs/miR-140和游离miR-140在核酸酶中的稳定性,证明AuNPs/miR-140是否能保护miR-140免受核酸酶降解。结果表明,PEI还原法制备AuNPs,方法简便,条件可控,最佳制备条件为:PEI体积为400 μL,反应温度为60℃,反应时间为2h。制备得到的AuNPs水溶液外观呈澄清的酒红色,微观上呈球形的粒子,大小均一,分散性良好,粒径为(22.31±4.41)nm,PDI 为(0.25±0.03),zeta 电位为(32.23±1.16)mV;静电吸附法制备的AuNPs/miR-140复合物,在质量比(Au:miR-140)为28.8:1时具有最小的粒径(27.04±2.59 nm)、合适的电位(30.4±1.93 mV)且能被完全压缩;并且AuNPs/miR-140复合物在有核酸酶的条件下能稳定存在至少24 h,这能保证在体内治疗骨关节炎时,复合物可以在miR-140进入细胞发挥作用之前保护其免受降解,从而使miR-140更好地发挥治疗效果。2.AuNPs/miR-140复合物的体外评价首先,选用软骨细胞进行体外培养,以PEI作为阳性对照,采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法考察AuNPs/miR-140和PEI/miR-140复合物对软骨细胞的毒性;然后,将miR-140用cy3进行标记,通过荧光显微镜与流式细胞仪,考察AuNPs/miR-140和PEI/miR-140复合物的入胞能力大小;最后通过实时定量聚合酶链式反应实验来测定miR-140转染进入细胞后,细胞中miR-140、Ⅱ型胶原信使RNA(COL2A mRNA)的相对表达水平,验证复合物的体外基因调控效果。细胞毒性的实验结果显示,在3.125～200 nM的浓度范围内,AuNPs/miR-140组软骨细胞存活率大于90%,而PEI/miR-140组在200 nM时的细胞存活率却降到了78%,表明AuNPs/miR-140复合物比PEI/miR-140复合物具有更小的细胞毒性;细胞转染实验结果表明,AuNPs/miR-140和PEI/miR-140的软骨细胞转染率均接近100%,两者均能高效地将miR-140转染进软骨细胞,但AuNPs/miR-140组软骨细胞中的荧光强度要弱于PEI/miR-140组细胞中的荧光强度,AuNPs递送miR-140入胞的能力较PEI仍略低,但PEI比AuNPs有更高的细胞毒性,综合考虑,AuNPs是一种安全高效的基因递送载体;实时定量聚合酶链式反应实验结果表明,AuNPs/miR-140复合物能使软骨细胞中的miR-140上调220倍,COL2A mRNA上调1.37倍,对软骨的修复有积极意义。3.氯诺昔康和microRNA-140联合治疗骨关节炎的药效学研究首先,建立大鼠骨关节炎模型。以大鼠为模型动物,通过关节腔注射木瓜蛋白酶法建立大鼠骨关节炎模型。通过测定膝关节的宽度,初步证明大鼠骨关节炎模型成功建立。然后,将大鼠分组并给药。A组为正常对照组(未造模),将造模大鼠分为B、C、D、E、F五个组,B为骨关节炎的模型组、C为游离miR-140组、D为药物(Lnxc-sol)组、E为AuNPs/miR-140复合物组、F为联合治疗组。B组关节腔注射生理盐水;C组注射游离miR-140;D组注射Lnxc-sol、E组注射AuNPs/miR-140复合物,以上各组每周注射一次,连续注射六周;F组先关节腔注射Lnxc-sol,每周一次,连续三周;从第四周开始关节腔注射AuNPs/miR-140复合物,每周一次,连续注射三周。最后,对大鼠进行一系列处理,验证采用不同的治疗方法后,造模后的大鼠关节软骨修复的程度和炎症改善的情况。记录实验过程中大鼠的膝宽与体重;于末次给药后一周处死大鼠,取出大鼠的股骨踝、胫骨平台以及滑膜,进行外观观察并拍照;将股骨踝和胫骨平台切片后进行HE染色和番红O-固绿染色,显微镜观察染色后的软骨切片并进行ManKin评分;将滑膜切片后进行HE染色,显微镜观察染色后的滑膜切片并进行滑膜的组织病理学评分。实验结果显示,关节腔注射木瓜蛋白酶造模后的大鼠体重均小于正常的大鼠,但给药后到处死大鼠前各组大鼠的体重无显著性差异;造模后大鼠的平均膝宽从约9 mm增加到约10.1 mm,末次给药后一周B组和C组大鼠的平均膝宽分别为10.80 mm和10.75 mm,两者大小无统计学差异,而D组、E组以及F组大鼠的平均膝宽分别为9.72、9.81和9.58 mm,明显小于B组的平均膝宽;外观观察结果显示A组大鼠软骨表面光滑有光泽,B组和C组大鼠的软骨受损严重,表面光泽度降低且可见较深的裂隙,而D组、E组大鼠的软骨损伤得到一定程度的修复,且F组大鼠软骨几乎和A组一样,仅见小的病变;软骨的HE染色、番红O-固绿染色和ManKin评分结果显示,A组大鼠软骨无损伤,其余各组大鼠软骨损伤程度的排序为B组≈C组>D组≥E组>F组;滑膜的HE染色以及其组织病理学评分结果显示,A组大鼠滑膜无炎症,其余各组滑膜炎症轻重的排序为:B组≈C组>E组>D组≈F组。以上结果表明大鼠骨关节炎模型建立成功,骨关节炎可造成大鼠软骨损伤和滑膜炎症,注射生理盐水和游离miR-140不能缓解造模后大鼠骨关节炎的症状,但Lnxc-sol和AuNPs/miR-140能起到治疗大鼠骨关节炎的作用,且两者联合应用来治疗骨关节炎效果更好,其可起到消除炎症和修复软损伤的双重作用,具有极大的科研和应用价值。结论:本课题成功制备了载microRN-140的金纳米粒,其粒径电位合适且在核酸酶中有很好的稳定性;体外细胞实验表明,金纳米粒是一种安全高效的基因递送载体;体内药效学实验表明,Lnxc-sol和AuNPs/miR-140联合治疗骨关节炎起到了消除炎症和修复软骨损伤的双重作用,达到了实验预期的目的,具有极大的社会效益和应用价值。