中晚期肝癌的主要治疗手段是经肝动脉化疗栓塞(TACE)。TACE通过栓塞供血动脉造成肿瘤缺血缺氧,产生坏死。但TACE造成的肿瘤微环境乏氧(hypoxia)可诱导残存的癌细胞产生适应性应答反应,导致肿瘤侵袭转移能力提高。如何降低TACE后肝癌细胞的乏氧应答成为提高TACE远期疗效的关键。Sorafenib是一种多激酶抑制剂,具有多个治疗靶点,已被证实可以显著延长肝癌患者的生存时间。将sorafenib与TACE结合能否进一步提高患者的预后是目前临床研究的热点。有研究显示二者联合会产生协同效应,但具体机制不明,sorafenib是否通过抑制肝癌的乏氧应答来提高TACE的疗效尚不十分清楚。此外,sorafenib虽然可以延长肝癌患者的生存时间,但在治疗的反应率方面却并不突出,部分获益患者的肿瘤甚至一直在增长。如何准确的反映和评价sorafenib的疗效,需要我们寻找新的评价手段和方法。Sorafenib作为一种靶向治疗药物,价格昂贵,如能早期判定其对某个特定患者是否起效以及何种剂量下起效,临床上可以指导无效患者尽早停药及更换药物,减轻患者的经济负担;对于因服药副反应严重而需要减量的患者,可以监测并指导合理的用药剂量。针对上述问题,本研究课题拟从以下三个方面进行系统性研究。一、Sorafenib对肝癌细胞乏氧应答的干预作用研究材料和方法:人肝癌SMMC-7721细胞常规培养至70%融合后,分成如下三组:(1)正常条件培养的SMMC-7721细胞;(2)乏氧培养24h的SMMC-7721细胞;(3)加入sorafenib(4μmol/L)预处理的SMMC-7721细胞进行乏氧培养24h。采用CCK-8检测各组细胞的增殖活性;流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期分布;细胞粘附实验检测各组细胞粘附性变化;Boyden小室侵袭实验检测各组细胞侵袭性变化。结果:(1)细胞增殖活性显示:乏氧培养组(150μM Co Cl2,24h)与对照组相比细胞增殖能力略有增加,但差异不显著(P>0.05),sorafenib(4μmol/L 1h)预处理后再乏氧培养组与对照组及乏氧培养组相比,细胞增殖能力降低,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。(2)细胞周期检测显示:乏氧培养组(150μM Co Cl2,24h)与对照组相比S期细胞比例降低,G0/G1期和G2/M期细胞比例增加;sorafenib处理组与对照组相比,S期细胞也有所降低,但差异均不显著(P>0.05),而G0/G1期细胞显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05),G2/M期细胞几乎无改变;sorafenib处理组与乏氧培养组比较,S期细胞比例有所升高,接近对照组水平,而G2/M期细胞则明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05),与对照组接近。(3)细胞粘附能力显示:乏氧培养组的细胞粘附能力与对照组相比略有增加,经sorafenib处理后,细胞粘附力显著降低,差异具有极显著统计学意义(P<0.001)。(4)Boyden小室侵袭实验显示:乏氧培养组(150μM Co Cl2,24h)与对照组相比细胞侵袭力降低(P<0.05);sorafenib预处理组与对照组及乏氧组相比,细胞侵袭力均有非常明显降低,差异具有明显统计学意义(P<0.01)。结论:(1)乏氧可诱导人肝癌SMMC-7721细胞产生乏氧应答,表现为肿瘤细胞增殖及粘附能力增强,细胞周期G0/G1期和G2/M期阻滞。(2)SMMC-7721肝癌细胞在sorafenib预处理后再进行乏氧培养,其乏氧应答反应被明显抑制,表现为肿瘤细胞增殖及粘附能力降低,细胞周期阻滞部分逆转,侵袭能力进一步降低等,证实sorafenib在抑制人肝癌细胞乏氧应答中发挥重要作用。二、Sorafenib抑制乏氧肝癌细胞活体致瘤能力的实验研究材料和方法:采用体外GFP(绿色荧光蛋白)转染人肝癌SMMC-7721细胞,嘌呤霉素杀灭进行SMMC-7721-GFP稳定细胞株筛选,获得稳定表达GFP的SMMC-7721细胞株。将16只BALB/c裸鼠随机分成4组,每组4只,用1ml注射器于每只裸鼠背部皮下注射约2×106个接受不同条件处理的SMMC-7721-GFP细胞。A组裸鼠注射正常条件培养的SMMC-7721-GFP细胞;B组裸鼠注射乏氧培养的SMMC-7721-GFP细胞;C组裸鼠注射sorafenib预处理后再乏氧培养的SMMC-7721-GFP细胞;D组裸鼠按照C组条件处理后的裸鼠再每日喂食sorafenib。对各组裸鼠分别在肿瘤接种的第2、9、16、23、30和40天时采用游标卡尺体外测量裸鼠瘤灶的长与宽,计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,40天后处死裸鼠,取出肿瘤称重并进行VEGF、CD34免疫组化染色。结果:嘌呤霉素杀灭曲线确定杀灭全部未感染病毒细胞的最小浓度为4ug/ml。按照此浓度的嘌呤霉素筛选4代获得稳定表达GFP的SMMC-7721细胞株,经不同的预处理后注入裸鼠皮下成瘤。(1)肿瘤体积比较:成瘤第23天时D组裸鼠瘤体积较A组(对照组)明显小(P<0.05);成瘤30天时,C组裸鼠瘤体积与A组相比差异具有统计学意义(P<0.05);至成瘤40天时,D组及C组裸鼠的成瘤体积与A组相比差异均有极显著统计学意义(P<0.001);B组裸鼠在各时间节点的成瘤体积上与A组相比差异无明显统计学意义(P>0.05)。(2)肿瘤重量比较:裸鼠成瘤40天时,D组裸鼠瘤重量明显低于其他三组,差异具有显著统计学意义(P<0.01),而各组裸鼠的总体重在各个时间节点的差异均无统计学意义(P>0.05)。(3)免疫组化结果比较:相对于A组,B组VEGF及CD34的表达较A组略有增高,而C则较A组略有减低,但差异均无统计学意义(P>0.05);D组裸鼠相对于A组VEGF及CD34的表达明显减低,差异均具有明显统计学意义(P<0.05,P<0.01),显示了sorafenib预处理及持续胃灌药可以显著抑制VEGF及CD34的表达。结论:(1)通过构建GFP荧光慢病毒质粒转染人肝癌SMMC-7721细胞,通过嘌呤霉素筛选可以获得稳定表达GFP的SMMC-7721细胞株。(2)裸鼠活体内成瘤实验显示,乏氧处理的瘤细胞随着sorafenib作用时间的延长,抑瘤作用更加明显。(3)基于成瘤标本的VEGF与CD34免疫组化对照研究,进一步验证了持续应用sorafenib可通过抑制肿瘤的血管生成及粘附侵袭能力而达到联合治疗肿瘤的效果。三、光学分子成像活体监测成瘤生长及评价sorafenib早期疗效的研究材料和方法:人肝癌SMMC-7721细胞常规培养至70%融合后,按照实验第一部分方法分成三组进行预处理。12只BALB/c裸鼠适应性饲养1周后随机分成4组,每组3只,在裸鼠背部皮下注射成瘤。A组裸鼠:注射正常条件培养的SMMC-7721细胞;B组裸鼠:注射乏氧培养的SMMC-7721细胞;C组裸鼠:注射sorafenib预处理后乏氧培养的SMMC-7721细胞;D组裸鼠:按照C组条件处理后的裸鼠再每日喂食sorafenib。对接种的裸鼠分别在肿瘤接种第2、9、16、23、30和40天在荧光活体成像仪(IVIS LuminaⅡ)下进行活体成像,通过荧光强度观察肿瘤的生长情况及致瘤率,游标卡尺测量裸鼠瘤灶的长与宽,计算肿瘤体积(mm3)并绘制肿瘤生长曲线。皮下成瘤40天时采用荧光染料Cy5.5标记的Annexin V注入裸鼠体内,应用小动物活体成像仪(IVIS LuminaⅡ)在480nm和520nm的条件下捕捉小鼠体内发出的特异光子,进行肿瘤凋亡显像,通过IOD值反映肿瘤的凋亡情况并比较各组之间的凋亡差异。结果:(1)活体光学显像监测成瘤情况:各组裸鼠成瘤情况通过吸光度值检测结果显示,皮下成瘤30天后可以通过吸光度值的测定较准确的反映出种植瘤的生长变化情况,至40天时吸光度值测定结果显示:A组和B组裸鼠的吸光度值基本一致,而C组的吸光度值则相对较小,D组的吸光度值最小,这四组的吸光度值变化趋势与游标卡尺体外测量的结果相符。(2)活体光学成像评价sorafenib早期治疗肿瘤细胞凋亡情况:相对于对照组(A组),Co Cl2乏氧处理组(B组)和sorafenib预处理组(C组)的肿瘤细胞凋亡程度略有增高,但差异无明显统计学意义(P>0.05);Sorafenib预处理后继续胃灌药组(D组)可以显著诱导肿瘤细胞的凋亡,吸光度值达到9.165×1010,与A组相比(吸光度值3.897×109)差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:(1)GFP荧光标记的人肝癌SMMC-7721细胞在裸鼠体内成瘤情况可通过GFP活体荧光成像来显示和监测肿瘤的生长情况,并可通过吸光度值的变化评估和比较肿瘤大小。(2)采用Cy5.5标记的Annexin V能够靶向结合到肿瘤凋亡细胞上,并可通过分子光学成像显影和定量评估。(3)Sorafenib对肝癌的治疗效果至少可以在40天时通过Cy5.5标记Annexin V的凋亡光学分子成像技术进行检测和判断其疗效。