论文部分内容阅读
AcMNPVgp41是杆状病毒37个核心基因之一,其同源物存在于所有已完成测序的73种杆状病毒基因组中。苜宿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus)GP41是一种糖基化蛋白,定位于病毒衣壳与囊膜之间。本实验室筛查出与GP41相互作用的草地贪夜蛾蛋白:含“卷曲-卷曲-螺旋-卷曲-卷曲-螺旋”结构域蛋白 2(Coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing protein 2,CHCHD2)和甘氨酰-tRNA 合成酶(Glycyl-tRNA Synthetase,GARS);发现GP41与CHCHD2的相互作用位点在161-210AA之间,与GARS的相互作用位点在81-330AA之间。本文通过对AcMNPV GP41与这两种宿主蛋白的相互作用位点区段编码序列的点突变和对应的AcMNPV突变体的表型分析探讨这些病毒-宿主蛋白相互作用对病毒复制的影响。首先,选取位于AcMNPV GP41与CHCHD2和GARS互作位点区段的181 AA(亮氨酸,Leu/L)、182AA(脯氨酸,Pro/P)、187 AA(赖氨酸,Lys/K)、203 AA(谷氨酸,Glu/E)、206 AA(赖氨酸,Lys/K)、208 AA(亮氨酸,Leu/L)密码子进行点突变,将其分别突变成丙氨酸(Ala/A)密码子。将经过突变的GP41编码序列分别插入酵母双杂交诱饵载体质粒pGBKT7,将被各个诱饵重组质粒转化的Y187菌株分别再与包含CHCHD2和GARS编码序列的cDNA克隆的AH109酵母菌株进行杂交实验。实验结果显示gp41LPK/AAA、gp41EKL/AAA、gp41L181/A、gp41L208/A 这四种突变使得 GP41 与 CHCHD2、GARS互作丧失。gp41K187/A、gp41K206/A突变可能对GP41与CHCHD2的相互作用有一定影响,但对GP41与GARS的相互作用影响不大。gp41P182/A、gp41E203/A突变导致GP41与CHCHD2的相互作用显著减弱,但对GP41与GARS的相互作用影响较小。为了确定GP41与CHCHD2和GARS相互作用位点序列突变是否影响病毒的增殖,利用Bac-to-Bac系统将8个gp41突变子分别与同一拷贝的绿色荧光蛋白基因(egfp)或一拷贝的多角体蛋白基因(polh)一起插入gp41缺失突变体的polh位点,构建带有egfp标记的AcMNPV突变体vAcgp41LPK/AAA-egfp、vAcgp41EKL/AAA-egfp、vAcgp41L181/A-egfp、vAcgp4182/A-egfp、vAcgp41K187/A-egfp、vAcgp41E203/A-egfp、vAcgp41K206/A-egfp、vAcgp41L208/A-egfp和带有polh 标记的 AcMNPV 突变体 vAcgp41LPK/AAA-PH、vAcgp41EKL/AAA-PH、vAcgp41L181/A-PH、vAcgp41P182/A-PH、vAcgp41K187/A-PH、vAcgp41E203/A-PH、vAcgp41K206/A-PH、vAcgp41L208/A-PH。用这些AcMNPV bacmid突变体对Sf9细胞的转染-感染实验显示,包含 gp41P182/A、gp41EKL/AAA、gp41E203/A 或 gp41K206/A 的突变体在被转染细胞培养基中产生的感染性BV量接近甚至高于野生型和gp41敲除-回复型。而包含gp41LPK/AAA、gp41L181/A或gp41K187/A的突变体在被转染细胞培养基中只产生极少量有感染性的BV;包含gp41L208/A的突变体在被转染细胞培养基中产生有感染性BV多于gp41LPK/AAA、gp41L181/A和gp41K187/A突变体,但较野生型和gp41敲除-回复型少。这些突变体在被转染细胞中都能产生包涵体。对被vAcgp41L1811A-egfp、vAcgp41L208/A-egfp转染的细胞上清液中的BV基因组进行实时荧光定量PCR检测显示,这两种突变体在转染72小时后才释放少量BV。用gp41敲除突变体vAcgp41ko-PH、gp41缺失-异位回复突变体vAcgp41rep-PH、gp41L181/A突变体vAcgp41L181/A-PH转染Sf9细胞,在在48hpt、72hpt、96hpt收集细胞做超薄电镜切片观察。结果显示,用vAcgp41rep-PH转染的Sf9细胞核中,在不同时间点均可明显看到病毒形态发生过程中的各种典型特征,包括病毒发生基质、核衣壳有囊膜包被的病毒体和包含病毒体的包涵体以及大量正在出核的核衣壳;在vAcgp4lko-PH或vAcgp41L181/A-PH转染的细胞核内可以观察到病毒发生基质和核衣壳;在vAcgp41L181/A-PH转染细胞的核内,病毒发生基质和包涵体形成滞后,且有少量包涵体,但包涵体内没有囊膜包被的ODV,核内周边区域可见囊泡和少量疑似正在出核的核衣壳,但未见有囊膜包被的病毒体,能看到少量包涵体,但包涵体中没有病毒体。在vAcgp41ko-PH转染的细胞核内可见一些包裹许多核衣壳的囊泡,但同样未见有囊膜的病毒体;没有见到从细胞核释放的核衣壳,也没有看到包涵体。本文的实验结果显示,AcMNPV GP41 181AA突变阻断GP41与宿主蛋白CHCHD2和GARS的相互作用,同时也严重阻滞病毒核衣壳囊膜包被和BV释放,也阻断ODV形成;208AA突变也会阻断GP41与CHCHD2和GARS的相互作用,严重阻滞病毒BV的释放;187AA突变导致GP41与CHCHD2和GARS的相互作用明显减弱,同时也导致感染性BV产量显著下降。这些实验结果表明GP41与宿主蛋白CHCHD2和GARS的相互作用可能与病毒的形态发生有关。