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各种原因引起的内耳毛细胞损伤是引起前庭及听觉系统疾病的重要原因之一。阐明哺乳动物前庭毛细胞生长发育、凋亡与再生的信号转导机制将为进一步了解内耳疾病的病理、生理并最终为其防治提供理论依据。 目的 为研究前庭毛细胞的信号转导机制，建立大鼠前庭器官的体外培养模型；在此基础上观察蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）β1、β2、γ亚型的表达；观察佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA）诱导后大鼠前庭终器胞外信号调控激酶-2（extracelluar signal ragulated kinase-2,ERK2）亚型的表达及细胞增殖变化，探讨其与前庭器官信号转导间的关系。 可四旱巨大学学位论文 方法 1．采用体外器官培养方法，建立大鼠前庭器官体外培养模型。并通过透射 电镜方法观察前庭上皮细胞超微结构变化。 2．采用兔疫细胞化学法观察椭圆囊 PKC民、PKC P。PKC Y亚型的表达变化 及分布特点。 3．采用免疫细胞化学法观察椭圆囊ERKZ及细胞增殖的表达变化及分布特 点。 结果 1．建立大鼠前庭器官体外培养模型 本实验体外培养椭圆囊 IWk，培养期间观察培养物呈半透明状，无发黑， 培养液无混浊，12 h可见成纤维细胞沿移植物边缘游出，48 h内皮细胞聚集， 呈铺路石样，透射电镜观察细胞无肿胀，胞膜、胞核完整，线粒体幡无肿胀， 纤毛无脱落。 2．PKC P卜 PKC＊、PKC Y亚型的表达变化及分布特点 在新生鼠的前庭感觉上皮中，PKC表达很少，主要位于靠近细胞膜的细胞 浆中，PMA作用后，其表达明显增多，以 30 min时最多，主要位于细胞膜，PKC p。 免疫组化染色稍高于 PKCpl，纤毛亦呈阳性反应，其后逐渐减少。45 min时表 达仍高于对照组。而 PKC Y胞浆表达增加，胞膜无明显改变。 3．前庭上皮ERI｛2的表达及细胞增殖的变化 ERKZ在大鼠前庭上皮毛细胞和支持细胞中表达。主要位于胞浆，分布不均 匀，表达较弱。PMA作用后，ERKZ分布于前庭感觉上皮的毛细胞和支持细胞， 胞浆染色明显增强；Pffe组观察到5－滨脱氧尿核苦（brmodeo…dine，Brdu） 标记阳性细胞明显增多，阳性细胞位于支持细胞层及毛细胞层。 结论 1．器官培养是把器官原基放入近似体内环境的培养系统，保持原有组织之 5 可四罩匡大坐学位汐文 间的结构特征，人为控制培养条件，施加外在因素，可完成活体内无法完成的 实验研究。不仅可以在体外研究内耳的发育，也可以用于生理病理机制的研究。 是当今最常用于内耳研究的方法之一。 2．Pds诱导后大鼠前庭感觉上皮 PKC 6、Y亚型表达均发生变化，且不同 亚型抗原分布不完全相同。提示PKC在前庭感觉上皮细胞信号转导过程中可能 发挥重要作用，不同亚型可能具有不同的作用。 3．Pffe诱导后大鼠前庭感觉上皮ERKZ表达增高，细胞增殖明显增加，两者 相一致。ERKZ可能在哺乳动物前庭上皮细胞增殖、分化的信号转导途径中起主 要作用。本试验结果表明，在PMA诱导下，PKC及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen 砒DVat印DrO屹mh刊凹C，川m上m 衣坯羽反王父化，别肥唱阻，促不仕别涎降支 上皮生长及分化过程中，PKC及MAPK可能起着重要的作用。