鼻咽癌长链非编码RNA表达谱及FOXCUT的作用和机制研究

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背景:鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种在南中国及南亚地区非常普遍的头面部肿瘤,具有起病隐匿,容易转移的特征。目前所使用的放射治疗辅以化学治疗虽然极大的改善了 NPC的治愈率,但NPC患者的5年生存率仍只有70%左右,很大一部分复发或转移。同时,目前所使用的检测EB病毒判断NPC发生的检测方法敏感性和特异性不高,不足以满足临床需求。因此,探索NPC相关的基因分子,研究出新的诊断标志物和治疗靶点非常有必要。长链非编码RNAs(long noncoding RNA,lncRNAs)是人类基因组中一个探索较少的巨大的非编码区域,具有细胞和组织的特异性,可能存在未知的癌症驱动因素,最近作为癌细胞调控的一个潜在关键因子而引起了人们的关注。根据已有的报导,目前有关lncRNAs在NPC中的表达谱以及其发挥的功能和潜在机制的研究非常少,我们所知的只有MALAT-1、HOTAIR、H19等几种。FOXCUT(NR125804.1)是在编码蛋白基因FOXC1启动子的上游6p25位置的lncRNAs,文献报导其在乳腺癌和口腔鳞状细胞癌中高表达,但它在NPC中的表达模式及功能机制尚无研究。FOXC1是叉头框蛋白转录因子家族中的一员,它在多种恶性肿瘤中过度表达并参与到诱导EMT转化调节细胞增殖和转移过程中。而FOXCUT与FOXC1调控网络在NPC中的功能还从未被描述。目的:利用Illuminate HiSeqTM 2500高通量测序技术,从整体层面揭示NPC和慢性鼻炎组织中lncRNAs的表达谱差异,并对差异表达的lncRNAs进行生物信息学分析和靶基因预测;研究FOXCUT在NPC细胞和组织中的表达和功能。探讨FOXCUT和FOXC1在NPC细胞中的调控关系及对EMT途径相关分子的影响。方法:(1)应用Illuminate HiSeqTM 2500高通量分析4例NPC和4例慢性鼻炎组织的lncRNAs表达谱差异。(2)挑选5个lncRNAs用qPCR的方法在30例癌症和27例炎症组织中验证。(3)用antisense和up/down的方法预测差异表达的lncRNAs和mRNAs相关性。(4)ROC曲线评估这五个lncRNAs对NPC的诊断价值。(5)用 qPCR 方法检测 FOXCUT 在 NPC 细胞(5-8F,CNE1,CNE2,SUNE-1,6-10B)和组织(42例NPC和30例CNP)中的表达水平。(6)用χ2或Fisher精确检验分析FOXCUT与临床特征相关性。(7)构建siRNAFOXCUT,以CCK-8、细胞划痕、xCELLigence RTCA实时迁移、凋亡实验观察FOXCUT干扰后对5-8F和CNE2细胞的影响。(8)qPCR方法检测NPC细胞和组织中mRNAFOXC1表达水平。(9)构建siRNAFOXC1,用qPCR和westernn blot方法分析FOXCUT与FOXC1基因表达的关系。(10)降低FOXCUT的表达后,检测5-8F细胞中EMT相关标记物的变化情况。结果:(1)共筛选出296个差异表达的lncRNAs和2589个差异表达的mRNAs。(2)qPCR与测序结果趋势一致。(3)根据antisense分析方法比对出49对lncRNAs与mRNAs互补配对。通过Up/Down分析反法,比对出33对配对基因。FOXCUT 和 FOXC1 存在上游配对。(4)5 个 lncRNAs ENST00000418244,ENST00000505700,ENST00000480284,ENST00000424518,ENST00000628509(FOXCUT)曲线下的面积分别为0.831,0.764,0.620,0.827和0.873,提示这些差异表达的lncRNAs可能对NPC的诊断具有临床价值。(5)FOXCUT在NPC细胞和组织中表达升高(p<0.05)。(6)上调的FOXCUT和淋巴结分期(p=0.016)及癌症转移(p=0.017)相关。(7)FOXCUT下调后,NPC细胞的增殖和迁移能力受到抑制(p<0.05)。(8)mRNAFOXC1在NPC细胞和组织中表达升高(p<0.05)。(9)siRNAFOXCUT可以降低FOXC1的表达水平(p<0.05),而FOXC1表达水平的降低对FOXCUT无影响。(10)降低FOXCUT能改变EMT相关分子标记物 β-catenin、N-cadherin、VEGF-A 的表达水平(p<0.05)。结论:在NPC和慢性鼻炎组织中存在差异表达的lncRNAs分子,初步完成了lncRNAs在NPC中的表达谱研究。FOXCUT的异常表达具有促进鼻咽癌细胞增殖、迁移作用。LncRNAFOXCUT-mRNAFOXC1是鼻咽癌发生机制中一种新的调控模式。抑制FOXCUT的表达能部分逆转EMT过程,它可能是鼻咽癌未来的诊断标志物和治疗新靶点。
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