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球孢白僵菌Beauveria bassiana作为一种高毒力、广谱性昆虫病原真菌,广泛应用于防控农林害虫。球孢白僵菌不仅可以寄生昆虫,而且在寄主昆虫缺乏时,能够在不同生态环境中营腐生生活,土壤被公认为是昆虫病原真菌的重要蓄积库。 从感病虫体分离的昆虫病原真菌经形态学和分子生物学鉴定,同时检测其对西花蓟马的杀虫活性;试验中发现该菌株对重金属Cd(Ⅱ)具有忍耐性与吸附能力。因此将球孢白僵菌与Cd(Ⅱ)溶液混合后处理西花蓟马成虫,比较其与对照毒力差异性;同时,采用萌发率实验及球孢白僵菌对Cd(Ⅱ)离子的最小抑制浓度MIC实验检测球孢白僵菌对Cd(Ⅱ)溶液的忍耐能力及在 Cd(Ⅱ)胁迫下的繁殖能力;白僵菌在重金属 Cd(Ⅱ)作用下抗氧化酶系变化;利用qRT-PCR检测白僵菌中在不同处理条件下相关致病基因与抗性基因的表达差异性。主要结果如下: 1.球孢白僵菌鉴定 将室外采集的被虫生真菌侵染的僵蚕带回室内进行分离纯化获得Bb33A菌株,经形态学及ITS序列比对鉴定为球孢白僵菌。 2. Cd(Ⅱ)处理后球孢白僵菌对西花蓟马的毒力 试验结果表明,2×107个孢子/mL Bb33A分生孢子溶液处理西花蓟马(预蛹),9 d其死亡率达到94.93%,LT50为5.2 d;而经Cd(Ⅱ)处理后,致使西花蓟马死亡率在第9 d为89.66%, LT50为5.5 d;但经统计学分析二者致死率并无显著性差异,仍保持较高杀虫活性。 3.球孢白僵菌对Cd(Ⅱ)的吸附能力 Bb33A对Cd(Ⅱ)具有忍耐力及吸附能力。2×107个孢子/mL球孢白僵菌对Cd(Ⅱ)的吸附能力随时间呈上升的趋势,在第4 d达到最大值为30%左右;而当孢子浓度达到109个孢子/mL(实际应用浓度)时,对Cd(Ⅱ)的吸附率达到56.7%。细胞胞壁吸附是Cd(Ⅱ)吸附中的主要吸附方式,占总吸附率的97%。 4. Cd(Ⅱ)胁迫对球孢白僵菌分生孢子萌发和生长的影响 球孢白僵菌分生孢子的萌发和生长随着Cd(Ⅱ)浓度的增加呈下降的趋势。SDAY固体上Cd(Ⅱ)浓度达到1500 mg/L时,培养基上无菌落生长,即球孢白僵菌Bb33A对Cd(Ⅱ)的最低抑菌浓度为1500 mg/L。液体培养基中Cd(Ⅱ)浓度达到300 mg/L时,球孢白僵菌Bb33A分生孢子萌发率为0。 5.球孢白僵菌在重金属Cd(Ⅱ)作用下抗氧化酶系变化 Cd(Ⅱ)胁迫初始阶段(2~6 h),球孢白僵菌分生孢子中POD活性出现抑制现象,POD对Cd(Ⅱ)胁迫较敏感。Cd(Ⅱ)胁迫4 h后,GST、SOD、CAT酶活性均显著增加;GST活性在Cd(Ⅱ)胁迫早期酶活变化最为明显,后期GST活性较低,因此其保护作用较弱;POD的活性变化则与GST相反,POD在Cd(Ⅱ)胁迫后期对菌体细胞起到关键的保护作用;Cd(Ⅱ)胁迫下,CAT活性稳定且变化不明显但仍高于正常状态下的CAT酶活性;SOD始终保持高的酶活性。在这些抗氧化保护酶中,以SOD最为重要。结果表明抗氧化酶活性的提高与维持是球孢白僵菌耐Cd(Ⅱ)胁迫的重要生理基础。 6.球孢白僵菌在Cd(Ⅱ)胁迫下的相关基因表达差异性 Bb33A菌株Cd(Ⅱ)胁迫下白僵菌菌素基因表达量降低,但仍保持较高水平,这与Cd(Ⅱ)处理后该菌株杀虫效果无明显差异相一致。其中P45052、Bbmpd、hsp70基因在球孢白僵菌侵染西花蓟马过程及Cd(Ⅱ)胁迫处理过程表达量均显著提高。与杀虫及Cd(Ⅱ)抗性都相关的基因并不是单一的,而是多种基因发挥作用,其中最主要的是P45052、Bbmpd、hsp70基因。 因此,球孢白僵菌Bb33A既对西花蓟马有较高杀虫毒性,同时对Cd(Ⅱ)有较强的耐性与吸附能力。可广泛应用于农林业中,达到防治害虫的同时吸附土壤中的重金属Cd(Ⅱ),降低农作物的Cd(Ⅱ)吸附,从而对农作物具有保护作用。