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第一部分DEX对哮喘BALB/c小鼠气道上皮修复和AHR形成的影响目的：观察地塞米松(DEX)对哮喘气道上皮及气道高反应(AHR)的影响,了解气道中性粒细胞和气道脱落上皮细胞在其中的相关性。方法：将哮喘小鼠分为四组：正常对照组(naive)、哮喘组(asthma)、哮喘低剂量激素干预组(asthma+DEXl)、哮喘高剂量激素干预组(asthma+DEX5)。在最后一次雾化24h内,小鼠依次进行AHR检测、支气管肺泡灌洗和BALF细胞计数、或取气管和肺病理组织。BALF细胞沉渣涂片用于细胞分类计数。病理组织用于HE染色、抗Ki-67或caspase3免疫组化染色。结果：短程DEX干预可加剧哮喘气道上皮的缺损。DEX尽管能明显下调哮喘气道中性粒细胞等炎症细胞数,但是在AHR控制方面仍不甚理想。抗Ki-67免疫组化染色显示DEX抑制了哮喘气道上皮细胞的分裂,抗caspase3免疫组化染色显示DEX抑制气道上皮细胞凋亡的效果有限。气道中性粒细胞与脱落气道上皮细胞呈明显相关性,此外两者与AHR指标penh50均呈明显正相关。结论：短程DEX干预一定程度上减少了哮喘气道上皮细胞的丢失,但同时也明显抑制了气道上皮的增殖,进而导致了气道上皮缺口的扩大。此外,气道中性粒细胞聚集也可能会加重气道上皮的损伤。气道上皮损伤和中性粒细胞气道聚集可能是引起哮喘AHR的密切相关因素。第二部分Vit A对哮喘BALB/c小鼠气道上皮增殖、凋亡及气道炎症的影响目的：观察Vit A对哮喘气道上皮完整性及哮喘气道炎症的影响。方法：将哮喘小鼠分为四组：正常对照组(naive)、哮喘组(asthma)、哮喘低剂量Vit A干预组(asthma+VitA25)、哮喘高剂量Vit A干预组(asthma+VitA250)。在最后一次雾化24h内,小鼠依次进行AHR检测、支气管肺泡灌洗和BALF细胞计数、或取气管和肺病理组织。BALF上清液用于细胞因子检测,细胞沉渣涂片用于细胞分类计数。病理组织用于HE染色、抗Ki-67或caspase3免疫组化染色。结果：Vit A可减少哮喘气道脱落上皮数,明显减轻了气道中性粒细胞的聚集,并下调气道TGF-β1水平。抗caspase3免疫组化染色显示Vit A能抑制气道上皮细胞凋亡,且明显下调AHR。抗Ki-67免疫组化染色未明确显示Vit A对哮喘气道上皮增殖的促进作用。气道中性粒细胞与脱落气道上皮细胞、气道中性粒细胞数量与AHR指标penh50均呈相关性。结论：Vit A可明显减轻哮喘小鼠气道上皮的损伤,下调AHR和中性粒细胞的聚集。尚未明显观察到VitA是否促进气道上皮的增殖。气道中性粒细胞聚集可加重气道上皮的损伤,与AHR密切相关。第三部分DEX联合GILZ沉默和联合Vit A对BALB/c哮喘小鼠气道上皮和气道炎症的影响目的：观察GILZ基因沉默或Vit A是否逆转DEX对哮喘气道上皮的负面影响。方法：雾化激发前4d将GILZ沉默腺病毒或空载腺病毒感染哮喘小鼠,其余干预同前。在最后一次雾化24h内,小鼠依次进行AHR检测、支气管肺泡灌洗和BALF细胞计数、或取气管和肺病理组织。BALF细胞沉渣涂片用于细胞分类计数。病理组织用于HE染色、抗Ki-67或caspase3免疫组化染色。结果：DEX联合GILZ基因沉默或Vit A都明显减少了哮喘气道脱落上皮数,DEX联合Vit A可明显下调哮喘AHR。抗caspase3免疫组化染色显示DEX联合Vit A可明显抑制气道上皮细胞凋亡；DEX联合GILZ基因沉默轻度下调气道上皮细胞凋亡水平。抗Ki-67免疫组化染色未明确显示GILZ基因沉默、Vit A联合DEX对哮喘气道上皮增殖的促进作用。结论：Vit A和GILZ基因沉默可明显减少DEX引起的哮喘小鼠气道上皮损伤,但两者对气道上皮增殖的影响尚不明确。第四部分DEX、VitA和GILZ沉默对哮喘小鼠气道EGFR/Raf-1/MEK/Erk信号通路的影响目的：观察DEX和Vit A对EGFR/Raf-1/MEK/Erk信号通路的影响；探讨DEX和Vit A通过调节GILZ影响EGFR/Raf-1/MEK/Erk信号通路的作用。方法：提取各组小鼠肺组织inRNA,合成cDNA,通过qPCR方法检测EGFR/Raf-1/MEK/Erk信号通路各分子的转录活性。提取小鼠肺组织蛋白,通过Western Blot (WB)方法检测EGFR/Raf-1/MEK/Erk信号通路各分子的表达及活化情况。通过免疫组化方法检测相关分子的组织分布和含量变化。结果：qPCR和WB显示DEX和Vit A可以改变Raf-1、MEK1/2和Erkl/2的转录活性和表达水平。免疫组化显示DEX可以诱导肺部GILZ的表达,且DEX浓度越高,诱导越明显；Vit A对GILZ的表达无明显影响；DEX减弱了Erk1/2的表达,但联合维生素则可维持相对较高的Erkl/2表达；GILZ沉默可以增强Erkl/2的表达。结论：DEX通过诱导GILZ参与Raf-1/MEK/Erk信号通路的负向调控。Vit A一定程度上可维持Raf-1/MEK/Erk信号通路的活性。