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黄芩苷(baicalin)是一种从黄芩植物根部提取的传统中药单体,因其具有抗氧化、抗凋亡、抗炎症等功能,被用于治疗多种由炎症因子引起的疾病,同时在生殖上具有治疗不孕不育,保胎的作用。然而,baicalin对于卵母细胞体外成熟(IVM),胚胎体外发育的影响及其机制尚不清楚。卵母细胞IVM和胚胎体外培养会受到高浓度活性氧(ROS)的破坏作用使其效率降低,这使卵母细胞和胚胎相关机理的研究及二者在辅助生殖技术上的应用都受到很大限制。因此本实验在猪卵母细胞IVM培养液和胚胎IVC培养液中添加baicalin可以通过抑制凋亡显著提高卵母细胞IVM能力、卵母细胞质量、胚胎体外发育能力、胚胎质量。同时,利用成年雄性昆明鼠体内实验验证baicalin对酒精诱导精子损伤的保护作用。一、Baicalin对猪卵母细胞IVM及其后胚胎体外发育能力的影响1.本实验探索不同浓度的baicalin对猪卵母细胞IVM能力的影响,发现0.1μg/mL和0.5 μg/mL的baicalin均可以显著的提高猪卵母细胞IVM 能力(68.1,70.2 vs.59.7;P<0.05)。Baicalin 具有显著的抗氧化能力,因此,通过荧光染色的方法发现0.05,0.1和0.5μg/mL baicalin处理组中卵母细胞内产生活性氧(ROS)水平均显著的低于对照组(P<0.05)。在最小试验药物浓度获得最佳实验效果的原则下,后续实验选择0.1 μg/mL的baicalin作为最佳处理浓度。同时RT-PCR结果显示baicalin处理组中卵母细胞和卵丘细胞的促凋亡相关基因(Bax)mRNA表达量显著低于对照组(P<0.05)。2.荧光染色和RT-PCR方法进一步检测baicain处理后卵母细胞的质量,结果显示0.1μg/mL的baicalin处理组中线粒体潜能性(△Ψm)和ATP含量均显著的高于对照组(P<0.05)。同时,RT-PCR检测到baicalin处理组中卵母细胞成熟相关基因(BMP15,GDF9,CyclinB,CDK1)和卵丘细胞扩增相关基因(PTGS1,PTX3,TNFIP6,SHAS2)的mRNA表达量显著的高于对照组(P<0.05)。3.检测baicalin处理的卵母细胞经孤雌激活(PA)后胚胎的体外发育能力。结果显示处理组获得的胚胎体外发育能力显著的高于对照组(49.5 vs.27.2;P<0.05)。同时,baicalin处理后获得的胚胎发育到囊胚阶段时细胞数也显著的高于对照组(P<0.05)。RT-PCR检测到baicalin处理组中胚胎达到囊胚阶段时全能性相关基因(Nanog,Sox2)和Bcl2基因的mRNA表达量显著的高于对照组(P<0.05),而Ba基因mRNA表达量显著的低于对照组(P<0.05)。同时,Tunel染色发现baicalin处理组囊胚细胞凋亡数显著的低于对照组(P<0.05)。二、Baicalin对PA,体细胞核移植(SCNT)和体外受精(IVF)胚胎发育能力的影响1.检测baicalin对猪PA胚胎体外发育能力的影响。结果表明0.1μg/mL的baicalin处理可以显著提高猪PA胚胎的体外发育能力(21.7 vs.36.7;P<0.05),囊胚细胞数也显著高于对照组(P<0.05)。Tunel染色检测了囊胚的质量,结果显示baicalin处理组囊胚凋亡细胞数显著的低于对照组(P<0.05)。RT-PCR结果表明全能性基因(Oct4,Sox2)的mRNA表达量显著高于对照组(P<0.05)。Bax和Bcl2基因的mRNA表达量显著低于和高于对照组(P<0.05)。2.检测baicalin对猪PA胚胎ROS表达量,Bax和Bcl2基因mRNA表达量,△Ψm,ATP含量的影响。利用荧光染色检测0.1μg/mL baicalin处理对猪PA胚胎质量的影响,结果显示baicalin处理组2/4-cell时期ROS的表达量显著低于对照组和其他浓度处理组(P<0.05)。同时RT-PCR结果显示胚胎在2/4-cell时期Bax基因的mRNA表达量均显著的低于对照组(P<0.05),Bcl2基因在2-cell时期的mRNA表达没有显著的变化,而在4-cell时期mRNA的表达量显著高于对照组(P<0.05)。同时,荧光染色显示baicalin处理组中△Ψm和ATP含量显著高于对照组(P<0.05)。3.检测baicalin处理对猪PA胚胎中sonic hedgehog(SHH)信号途径的影响。RT-PCR结果显示,baicalin处理组中SHH信号途径相关基因(SHH,PTCH1,GdI1,SMO)的mRNA表达量均显著高于对照组(P<0.05)。免疫荧光染色检测发现baicalin处理可以显著的提高SHH信号途径相关蛋白(SHH,GLI1)的表达量。为了进一步检测baicalin处理对胚胎体外发育能力影响的机制,我们将胚胎分为三个组:对照组;baicalin处理组;baicalin和SHH信号抑制剂(Cyclopamine,Cy)共同处理组,结果显示Cy可以恢复baicalin对胚胎产生ROS和凋亡的抑制作用及baicalin对△Ψm和ATP含量的增加。最后,我们检测三个处理组胚胎的体外发育能力,结果显示Cy可以抑制baicalin对胚胎体外发育能力的提高。4.检测0.1 μg/mL baicalin对猪SCNT和IVF胚胎的影响。结果表明0.1 μg/mL的biacalin可以显著提高猪SCNT和IVF胚胎的发育能力(14.9 vs.25.9;14.9 vs.25.9;P<0.05)。三、Baicalin对酒精诱导的成年雄性昆明鼠精子损伤的保护作用1.本实验建立了酒精诱导成年雄性昆明鼠精子损伤模型。实验分为两组,10只同窝出生,表型一致的成年雄性昆明鼠随机分为实验组和对照组,每组各5只。实验组进行每天连续四周酒精灌胃实验,灌胃剂量按酒精质量和小鼠体重比如下:第一周每天2g/kg、第二周每天4g/kg、第三周每天6 g/kg、第四周每天8 g/kg、对照组饲喂等量的生理盐水。第四周结束时对小鼠进行剖检,检测到小鼠体重下降,死亡率增加,精子密度显著的低于对照组(P<0.05)。2.检测不同浓度baicalin处理对酒精诱导成年雄性小鼠精子损伤的保护作用。实验分为对照组(等量生理盐水)、酒精组、酒精和25 mg/kg baicalin共同处理组、酒精和50 mg/kg baicalin共同处理组(mg/kg即baicalin重量和小鼠体重比值,酒精剂量按照实验一)。结果显示,50 mg/kg的biacalin灌胃量对酒精诱导的小鼠精子密度下降和精子畸形率升高等具有部分保护作用(P<0.05)。3.检测不同浓度baicalin对酒精诱导的成年雄性昆明鼠睾丸组织凋亡和炎症因子相关基因mRNA表达量的影响。结果显示,酒精处理会显著的增加睾丸组织中凋亡基因(Caspse3,Bax)和炎症因子(IL-6,TNF-a)mRNA表达量,同时降低Bcl2基因mRNA的表达量(P<0.05)。相比于酒精组,50 mg/kg的biacalin处理可以显著降低caspase3,Bax,IL-6,TNF-a基因的mRNA表达量,同时提高Bcl2基因的mRNA表达量(P<0.05)。结论:本研究确定了 0.1 μg/mL baicalin可以显著提高猪卵母细胞IVM和PA,IVF及SCNT胚胎体外发育能力。主要表现为降低卵母细胞和胚胎中ROS水平,提高△Ψm和ATP含量等。同时证明baicalin是通过激活SHH信号途径来影响猪胚胎体外发育潜能。此外,本研究也进一步利用体内实验证明了 baicalin对酒精诱导雄性昆明鼠精子损伤具有潜在的保护作用。