维生素B₆包含六种可以相互转换的吡啶类化合物,它们分别是:吡哆醇（P-ridoxine,PN）,吡哆醛（Pyridoxal,PL）,吡哆胺（Pyridoxamin,PM）;以及对应的磷酸酯形式:磷酸吡哆醇（Pyridoxine-5’-phosphate,PNP）,磷酸吡哆醛（P yridoxal-5’-phosphate,PLP）和磷酸吡哆胺（Pyridoxamine-5’-phosphate,PMP）。其中PLP是VB₆的活性形式,是140多种酶的辅酶,涉及氨基酸的多种反应,在许多物质的合成、代谢转换过程中发挥着重要作用。PLP在维持机体生化稳态方面具有重要作用,包括:生物体内氨基酸的代谢以及它自身化学结构的特点,活泼的醛基使它极易与含有氨基的化合物结合,生成醛亚胺类物质对生命体的正常活动产生影响。因此必须将VB₆中的其他形式转化为PLP。通常参与代谢的酶有ATP依赖性PL激酶和FMN依赖性PNP氧化酶。而PLP的水解是控制细胞内游离PLP水平的一个重要机制,因此可催化PLP水解的磷酸酶对维持生物体内PLP浓度在一个正常范围具有重要意义。本实验以模式植物烟草为材料,利用已经报道和验证过的人类特异性PLP磷酸酶的基因序列,在NCBI上通过比对找到预测编码烟草PLP磷酸酶基因（命名为NtPLPP）。该基因编码区包括951bp碱基,编码316个氨基酸,等电点为5.11,编码的蛋白质分子量约为34.157kDa。对其氨基酸序列进行功能域预测显示烟草NtPLPP基因与人的PLP磷酸酶同属一个家族,即HAD（卤代酸脱卤酶）蛋白超家族。通过NtPLPP与多物种氨基酸的同源性比对发现,它与其他普通磷酸酶不同,而与各物种PLP磷酸酶的关键保守位点均保持一致。本研究通过构建pMal-c2x-NtPLPP原核表达载体,并将其转化到大肠杆菌中进行原核表达,结果在上清中成功获得目的蛋白,对目的蛋白进行部分酶学性质分析。结果显示NtPLPP可以催化PLP生成PL,并且还得出以PLP为底物时的反应的最适pH为7.5、最适温度为60℃、酶促反应时间为20min。利用孔雀石绿法对不同磷脂型化合物进行酶活力测定,发现该酶对这些化合物都具有一定的催化活性,但还是以PLP为底物时活性最大。选取NtPLPP编码框内273bp的特异性片段,在植物下调载体pHANNIBAL内含子的两端分别插入其正反向片段,成功构建了NtPLPP RNAi载体,并利用农杆菌介导法对烟草叶片进行瞬时侵染,提取烟草叶片的总RNA。通过荧光定量RT-PCR进行检测,结果发现NtPLPP基因在侵染后48h的下调效果最好,其转录水平的表达量下降了59%,同时也检测了在侵染48h后,VB₆代谢转换相关基因NtPLK、NtPNPO和NtPLR表达量的变化情况,发现它们分别下降了46%、38%和本实验还通过构建NtPLPP-GFP绿色荧光融合蛋白表达载体,利用农杆菌转化法瞬时侵染烟草叶片,并使用LSM880激光共聚焦显微镜观察NtPLPP-GFP融合蛋白在烟草叶片中的分布情况,发现PLP磷酸酶在烟草叶片中大部分定位在叶绿体中,还有一部分定位在细胞质和细胞核中。