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我们实验室前期从一点红萝卜中总共分离、克隆获得了三种潜隐性的dsRNA病毒,分别命名为RasV1、RasV2、RasV3。其中RasV1与RasV2的基因组分别由3条dsRNA片段组成,最大的dsRNA片段编码病毒的RdRp,另外两条dsRNA片段编码病毒的CP。RasV3的基因组由两条dsRNA片段组成,最大的dsRNA片段编码病毒的RdRp,另外一条dsRNA片段编码病毒的CP。
基于一点红萝卜的研究,我们选取短叶十三、南畔洲、特大青头、大青皮、春秋四季红以及一点红等6种萝卜品种在温室种植,分别从叶片组织中大量提取dsRNA进行诊断分析,初步探讨6个萝卜品种中携带dsRNA病毒的情况。此对短叶十三萝卜中普遍携带的大小在3000 bp-4000 bp的可能构成同一病毒的3条dsRNA片段进行研究,采用经修改的单引物序列扩增方法(M-SPAT法)获得了3条dsRNA片段对应的cDNA克隆。测序分析显示3条dsRNA片段的大小分别为3638 bp、3517 bp、3299 bp,依次命名为RasCV1-R1、R2、R3。核苷酸序列比对分析显示RasCV1-R1、R2、R3的5’-UTR与3’-UTR都具有高度的序列相似性,保守序列分别为5’端5’-GAUAAAA-3’与3’端5’-AUAUAUUUGUC-3’。RasCV1-R1中包含一个单独的ORF(107 nt-3523 nt),编码1139 aa的蛋白,分子量大小为131kDa,BLAST-P搜索结果显示,该编码蛋白与Chrysoviridae科病毒编码的RdRp具有很高的序列相似性,并含有真菌dsRNA病毒RdRp中8个高度保守的motif;R2中包含一个3306 bp的ORF,编码1102 aa的蛋白,分子量大小为124 kDa,编码蛋白BLAST-P搜索显示,与Chrysoviridae科病毒编码的CP具有较高的序列相似性,多序列比对分析显示与Chrysoviridae科病毒CP的N端区域存在高度的保守区域;RasCV1-R3包含一个单独的ORF(135 nt-3122 nt),编码996 aa的蛋白,分子量大小为109 kDa,BLAST-P检索显示与Chrysoviridae科病毒编码的OUT蛋白酶具有很高的序列相似性,并包含OUT蛋白的4个保守的motif。另外RasCV1-R1、R2、R3的遗传进化分析显示与红掌花叶病毒(AmaCV)可能构成Chrysoviridae科的一个新的侵染植物的分类单元。
利用氯化铯密度梯度离心法从萝卜叶片组织中提取病毒样粒子,在氯化铯密度梯度中的范围为1.35-1.40 g cm-3,电镜观察病毒粒子为球状,直径约为35 nm。病毒粒子中提取基因组与从叶片组织中提取的dsRNA条带大小相一致,病毒基因组RT-PCR检测以及Northern杂交进一步验证了3条dsRNA片段的来源。另外对病毒结构蛋白的分段现象做了初步的分析讨论。
总之,本研究首次报道了从种子生长的植物中分离到一种新的Chrysoviridae科病毒的全基因组序列,并对该病毒可能的分类地位进行了讨论。