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在我国,宫颈癌(Cervical Cancer)发病率高居女性生殖系统肿瘤的第二位。化疗治疗宫颈癌的耐受性问题仍然是临床上亟待解决的难题,因此,非常有必要进一步探究宫颈癌对化疗药物耐受的相关机制。研究证明,异常表达的Notch1参与多种实体瘤与非实体瘤的发生和发展,且与多种肿瘤的放、化疗耐受相关。Notch受体通过与相应配体特异性结合调控下游靶点,发挥其促增殖和多种细胞分化的功能。该通路在调控细胞增殖、凋亡、促进或抑制人类肿瘤形成等方面发挥至关重要作用。Notch与多种信号转导途径有着重要结点,包括Ras、mTOR和NF-κB等信号转导途径。研究证实,在结肠癌和肺癌等肿瘤中均发现Notch受体和相应配体的高表达。目前,研究证实Notch1异常表达参与多种肿瘤的耐药,并且涉及多种抗癌药物。顺铂是临床上治疗宫颈癌的一线抗癌药物,通过损伤细胞DNA发挥抗癌作用。DNA损伤应答中起主开关作用的关键分子为ATM蛋白,其主要功能是在DNA损伤后启动修复途径,当损伤不能被及时修复时启动细胞凋亡程序。有研究表明Notch1在辐射造成的DNA损伤以及损伤应答通路中起直接的负调控作用。Notch1直接作用于ATM蛋白并抑制ATM激活,破坏ATM介导的相关信号转导途径。因此,我们基于以上研究进一步探讨Notch1活化参与顺铂诱导宫颈癌细胞DNA损伤的机制。我们应用免疫组织化学技术检测宫颈癌组织(66例)以及正常宫颈组织(15例)中Notch1和Ki67蛋白的表达。同时,对HeLa(腺癌细胞)和SiHa(鳞癌细胞)两种宫颈癌细胞作了单纯给予顺铂或联合DAPT(Notch1信号通路特异性抑制剂)来检测DNA损伤以及细胞凋亡情况。探究抑制Notch1活化对顺铂诱导宫颈癌细胞DNA损伤和凋亡的调控机制。目的:探究抑制Notch1活化对顺铂诱导宫颈癌细胞DNA损伤和凋亡的调控机制。方法:1.应用免疫组织化学技术检测Notch1和Ki67在宫颈癌组织、正常宫颈组织中的表达。2.应用CCK-8以及克隆集落形成实验检测顺铂对HeLa和SiHa细胞活力和增殖能力的影响。3.应用流式细胞术和Western Blot检测顺铂对HeLa和SiHa细胞DNA损伤的影响。4.应用激光共聚焦显微镜和Western Blot检测顺铂对HeLa和SiHa细胞中NICD表达水平的影响。5.应用CCK-8检测DAPT对HeLa和SiHa细胞活力的影响;应用Western Blot检测DAPT对HeLa和SiHa细胞中NICD表达的影响;应用CCK-8以及克隆集落形成实验检测DAPT联合顺铂对HeLa和SiHa细胞活力和增殖能力的影响。6.应用流式细胞术、TUNEL和Western Blot检测DAPT联合顺铂对HeLa和SiHa细胞DNA损伤的影响。应用Western Blot检测DAPT联合顺铂在不同时间作用下对SiHa细胞DNA损伤的影响。7.皮下接种SiHa细胞建立裸鼠异种移植瘤模型。观察DAPT联合顺铂腹腔给药对荷瘤小鼠的作用。免疫组织化学技术检测NICD和Ki67的表达情况;应用TUNEL检测细胞凋亡情况;对各组裸鼠心、肝、脾、肺和肾进行HE染色。结果:1.Notch1和Ki67蛋白在宫颈癌组织中呈高表达,且二者在宫颈癌组织中的表达呈正相关。2.随顺铂浓度倍增,HeLa和SiHa细胞活力和增殖能力被明显抑制。3.随顺铂浓度倍增,HeLa和SiHa细胞,γ-H2AX、p-ATM以及p-CHK2蛋白表达逐渐增加;在相对低浓度时,p-BRCA1蛋白表达水平被上调,而随着顺铂浓度增加,其表达逐渐减少;p-P53、P53、Cleaved-Caspase3蛋白表达逐渐增加;凋亡细胞数目逐渐增加。4.与对照组相比,实验组HeLa和SiHa细胞中NICD表达水平被上调。5.DAPT可以抑制HeLa和SiHa细胞活力和NICD蛋白的表达。与对照组、DAPT和顺铂组相比,联合组对HeLa和SiHa细胞活力和增殖能力的抑制程度更明显。6.与对照组、DAPT及顺铂组相比,联合组γ-H2AX、p-ATM、p-CHK2、p-P53、Cleaved-Caspase3、Cleaved-PARP蛋白表达水平被上调;与顺铂组相比,联合组p-BRCA1和P53蛋白表达减少,且凋亡细胞数明显增加;不同时间连续作用下(6h、12h、24h),联合组NICD蛋白表达被明显抑制,γ-H2AX,Cleaved-Caspase3,Cleaved-PARP蛋白表达逐渐增多。7.与对照组、单独给药组相比,联合给药组荷瘤体积较小,重量较轻。与顺铂组相比,联合组NICD蛋白表达减少;与对照组、单独给药组相比,联合组Ki67蛋白表达减少。HE染色显示各组裸鼠心、肝、脾、肺、肾组织均无异常。结论:1.与正常宫颈组织相比,Notch1在宫颈癌组织中呈高表达;宫颈癌组织中Notch1的表达与Ki67的表达呈正相关。2.顺铂可以诱导宫颈癌细胞DNA损伤以及ATM-CHK2-P53介导的细胞凋亡。3.抑制Notch1活化能够增强顺铂诱导宫颈癌细胞DNA损伤以及ATM-CHK2-P53介导的细胞凋亡。