胶艾汤首记载于东汉张仲景《金匮要略》,全方由阿胶、艾叶、甘草、当归、川芎、白芍、地黄七味药组成,该方临床主要治疗妇人冲任虚损,崩漏,月水量多,或伴分娩后下血不绝,或妊娠下血,腹中疼痛。四物汤始见于唐代《仙授理伤续断秘方》,由胶艾汤减去阿胶、艾叶、甘草三味药,地黄易为熟地,且增加当归、川芎两药味比例衍化而成。胶艾汤衍化为四物汤一是通过原方的精炼,突出了活血药功效组配的比重;二是通过调整剂量,增加了当归和川芎的比例,使得方剂功效向养血和血方向拓展。本课题前期着重研究胶艾汤衍化为四物汤的功效取向变化,而对胶艾汤衍化为四物汤功效取向变化的物质基础及作用机制研究甚少。因此本论文以胶艾汤、四物汤及其不同溶剂提取部位为研究对象,借助急性血瘀模型、子宫出血模型、血虚模型筛选四物汤活血、胶艾汤止血、补血作用的最强有效部位;借助UPLC-Q/TOF-MS对胶艾汤、四物汤及其不同溶剂提取部位的化学成分进行定性比较研究,为阐明胶艾汤衍化为四物汤功效取向变化的物质基础提供依据。论文研究内容主要包括以下几个部分:(一)文献研究通过查阅国内外相关文献,主要从胶艾汤、四物汤及相关药味的化学成分及药理作用两方面进行综述,清晰地了解胶艾汤、四物汤的研究现状,为本论文制定切实可行的实验方案,阐明胶艾汤衍化为四物汤功效取向变化的物质基础奠定基础。(二)四物汤对急性血瘀模型大鼠活血祛瘀有效部位筛选四物汤经水煎煮后,采用系统溶剂提取法分别得到四个溶剂提取部位。采用皮下注射盐酸肾上腺素加冰水浴复制大鼠急性血瘀模型,检测各组大鼠全血粘度、血浆粘度、凝血四项、血小板聚集率、血浆TXB2、6-keto-PGFla及子宫病理切片。结果表明,与模型组比较,乙酸乙酯组明显降低大鼠各切变率全血粘度、血浆粘度,明显延长TT,PT,APTT,明显降低FIB含量、血小板聚集率、血浆TXB2的含量,明显升高6-keto-PGFla的含量(P<0.01);石油醚组可明显降低高切变率下全血粘度(P<0.05),降低TXB2含量、升高6-keto-PGFla的含量(P<0.01);正丁醇组、水组可明显降低TXB2含量、升高6-keto-PGFla含量(P<0.01)。提示,四物汤不同溶剂提取部位均具有降低TXB2、升高6-keto-PGFla含量,调节TXB2/6-keto-PGFla平衡的作用,乙酸乙酯组还可明显降低大鼠各切变率全血粘度、血浆粘度,明显延长TT,PT,APTT,明显降低FIB含量,明显抑制血小板聚集等作用,四物汤乙酸乙酯部位为四物汤活血祛瘀的最强有效部位。(三)胶艾汤对子宫出血模型大鼠止血作用有效部位的筛选胶艾汤经水煎煮后,采用系统溶剂提取法分别得到四个溶剂提取部位。采用孕鼠联合灌胃米非司酮和米索前列醇复制大鼠子宫出血模型,检测各组大鼠雌二醇(E2)、孕酮(P)、促黄体生成激素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、凝血功能、血小板系统、子宫出血时间(UBT)、子宫出血量(UBQ)、子宫肉眼及组织形态图。结果表明,与模型组比较,乙酸乙酯组可明显升高 E2(P<0.01)、P(P<0.01)、LH(P<0.01)、FSH(P<0.01),明显缩短TT(P<0.01)、PT(P<0.01)、APTT(P<0.05),升高 FIB(P<0.01),升高 TXB2含量(P<0.01),降低 6-keto-PGFla 含量(P<0.01),调节 TXB2/6-keto-PGFla 平衡(P<0.01),明显缩短UBT(P<0.05),减少UBQ(P<0.01);正丁醇组可明显升高LH、6-keto-PGFla、调节 TXB2/6-keto-PGFla 平衡(P<0.01);水组可明显升高 E2、FSH、FIB(P<0.05),缩短 TT(P<0.05),升高 TXB2(P<0.01),降低 6-keto-PGFla(P<0.05),调节 TXB2/6-keto-PGFla 平衡(P<0.01),缩短 UBT(P<0.05)、减少 UBQ(P<0.05)。提示,乙酸乙酯部位为胶艾汤发挥止血作用的最强有效部位。(四)胶艾汤对血虚模型大鼠补血作用有效部位的筛选胶艾汤经水煎煮后,采用系统溶剂提取法分别得到四个溶剂提取部位。采取每天于眼底静脉丛放血5 mL·kg-1,连续放血12 d的方法,复制大鼠血虚模型,造模同时各组动物分别ig给予相应的供试品药物,检测各组大鼠外周血象、免疫器官指数、白细胞介素2(IL-2)和促红细胞生成素(EPO)水平以及红细胞膜能量代谢酶活性。结果表明,与模型组比较,胶艾汤正丁醇组可明显升高HCT、RBC、HGB、PLT(P<0.05、0.01);降低脾脏指数及EPO水平(P<0.05、0.01);明显升高胸腺指数、IL-2水平(P)<0.01),升高红细胞膜Ca2+,Mg2+-ATP酶及Na+,K+-ATP酶活性(P<0.05、0.01)。石油醚组可明显升高PLT及IL-2水平(P<0.01),降低EPO水平及脾脏指数(P<0.05、0.01)。乙酸乙酯组可明显降低脾脏指数及EPO 水平(P<0.01),升高红细胞膜Ca2+,Mg2+-ATP酶活性(P<0.05)。水组可明显升高PLT(P<0.05),降低EPO水平(P<0.01)。提示,正丁醇部位为胶艾汤发挥补血作用的最强有效部位。(五)胶艾汤乙酸乙酯部位与胶艾汤正丁醇部位不同比例组合对子宫出血模型大鼠止血功效的比较研究胶艾汤组方饮片加水煎煮后采用系统溶剂提取法得到胶艾汤乙酸乙酯部位与胶艾汤正丁醇部位提取物,胶艾汤乙酸乙酯部位与胶艾汤正丁醇部位按不同重量比组合后用0.5%CMC-Na溶液配制成各供试品溶液,采用孕鼠联合灌胃米非司酮与米索前列醇复制大鼠子宫出血模型,比较各组大鼠雌二醇(E2)、孕酮(P)、凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、血浆纤维蛋白原(FIB)、血栓烷素B2(TXB2)、6-酮-前列腺素(6-keto-PGFla)、TXB2/6-keto-PGFla、子宫出血时间(UBT)、子宫出血量(UBQ)。结果表明,与模型组比较,胶艾汤乙酸乙酯部位:胶艾汤正丁醇部位1:3组可明显缩短子宫出血模型大鼠TT、PT、APTT,升高模型大鼠FIB,缩短模型大鼠UBT,减少 UBQ,升高模型大鼠 TXB2、降低 6-keto-PGFla,调节 TXB2/6-keto-PGFla 的平衡,明显升高模型大鼠E2、P的含量。提示,胶艾汤乙酸乙酯部位:胶艾汤正丁醇部位1:3组较其它各给药组比较具有明显的缓解子宫出血模型大鼠的出血症状,为胶艾汤对子宫出血模型大鼠发挥止血作用的最佳配比。(六)胶艾汤、四物汤及其不同溶剂提取部位对机体特异性免疫和非特异性免疫功能影响的体外研究1.胶艾汤、四物汤及其不同溶剂提取部位对机体非特异性免疫功能影响的体外研究以体外培养的大鼠腹腔巨噬细胞作为研究对象考察了胶艾汤、四物汤及其不同溶剂提取部位对大鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能,增殖功能及体外诱生细胞因子的影响。结果表明,胶艾汤、四物汤及其各不同溶剂提取部位在安全剂量范围下均有不同程度的增强机体非特异性免疫功能的作用。胶艾汤与四物汤比较,胶艾汤有更强的促进巨噬细胞吞噬中性红、促进巨噬细胞增殖及提高细胞因子IL-12、TNF-αα含量从而增强机体非特异性免疫功能的作用,胶艾汤不同溶剂提取部位中胶艾汤正丁醇部位最能增强机体的非特异性免疫功能。2.胶艾汤、四物汤及其不同溶剂提取部位对机体特异性免疫功能影响的体外研究以体外培养的小鼠脾淋巴细胞作为研究对象考察了胶艾汤、四物汤及其不同溶剂提取部位对小鼠脾淋巴细胞体外增殖,ConA及LPS诱导的脾淋巴细胞增殖,细胞因子IL-2及TNF-oα含量的影响。结果表明,胶艾汤与四物汤均可促进小鼠脾淋巴细胞增殖及与有丝分裂原ConA、LPS协同促进小鼠脾淋巴细胞增殖,提升细胞因子IL-2、TNF-α的含量,且胶艾汤作用明显优于四物汤,胶艾汤不同溶剂提取部位中,胶艾汤正丁醇部位对上述指标改善作用最明显。(七)胶艾汤、四物汤及其各不同溶剂提取部位化学成分的UPLC/Q-TOF-MS定性分析采用 AB SCIEX Triple TOFTM5600 高分辨质谱,ACQUITY UPLC(?)HSST3C18 色谱柱(2.1×50 mm 1.8 μm),以0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱,ESI离子源在负离子模式下采集数据信息,借助Peak View SoftwareTM质谱分析软件进行数据分析。胶艾汤中共鉴定出73个化学成分,胶艾汤石油醚部位共鉴定出36个,胶艾汤乙酸乙酯部位共鉴定出58个化学成分,胶艾汤正丁醇部位共鉴定出65个化学成分,胶艾汤水部位共鉴定出58个化学成分,四物汤共鉴定出48个化学成分,四物汤石油醚部位共鉴定出25个化学成分,四物汤乙酸乙酯部位共鉴定出39个化学成分,四物汤正丁醇部位共鉴定出43个化学成分,四物汤水部位共鉴定出32个化学成分。(八)胶艾汤、四物汤各效应部位化学成分与药理作用相关性分析在前期(二)、(三)、(五)、(七)的工作基础上,通过SPSS分析软件中的双变量相关分析得出与补血作用呈显著相关的化学成分主要有芍药苷、氧化芍药苷、芍药苷亚硫酸酯、苯甲酰羟基芍药苷、牡丹皮苷E、夏佛托苷、甘草苷、异甘草苷、甘草香豆素、GlyasperinK、8-表番木鳖酸、尿嘧啶核苷、藁本内酯、芹菜素、鼠李素;与活血作用呈显著相关的化学成分主要有香草酸、咖啡酸、4-羟基-3-丁基苯酞、没食子酸、4-羟基-3-丁基苯酞异构体、没食子酸乙酯、反-阿魏酸、川芎内酯J;与止血作用呈显著相关的化学成分主要有没食子酸乙酯、丹皮酚、甘草酸、邻苯二甲酸二丁酯、3,6-二羟基-苯戊酮。其中芹菜素可同时发挥补血、活血作用,没食子酸乙酯可同时发挥活血、止血作用。