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目的 采用RT-PCR技术对中国白癜风患者外观正常的体外培养表皮黑素细胞vit-1基因mRNA表达水平进行检测，探讨vit-1基因mRNA表达水平与白癜风的发病的相关性，并为进一步研究白癜风的发病机制打下基础。 方法 一、研究对象 白癜风患者均来自杭州三院皮肤科门诊，共取2例稳定期泛发型白癜风患者外观正常臀部皮肤进行黑素细胞培养；对照组取健康男青年包皮环切术标本进行黑素细胞培养。 二、试剂 1．细胞培养试剂：培养液RPMI1640(Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；bFGF(Gibco公司)；CT(Gibco公司)；胰蛋白酶(Gibco公司)。 2．分子生物学试剂：DEPC(BBI公司)；Trizol试剂(上海生工)；GeneBuler 50bp DNA Ladder(MBI公司)；RNA PCR Kit(AMV)Ver.2.1(TaKaRa)；50×TAE缓冲液(上海生工)。 三、黑素细胞培养 取2例稳定期泛发型白癜风患者外观正常臀部皮肤标本及3例健康男青年包皮环切术标本，用RPMI1640培养液(含血清、CT、bFGF)，原代培养黑素细胞，当原代培养的黑素细胞生长至80-90％融合时，开始传代，并冻存部分细胞备用。 四、半定量RT-PCR 1．细胞总RNA提取：弃去培养液，以无RNA酶4℃ PBS(pH7.4)洗细胞2次，直接加入Trizol 1ml，细胞裂解后加入0.2ml氯仿混匀，离心后吸取上清，加入0.5ml异丙醇，离心沉淀后弃上清，70％乙醇洗沉淀2次。RNA溶于DEPC水，紫外微量检测仪检测浓度和纯度。RNA溶液加入RNase Inhibitor，置一78℃冰箱备用。 2.引物设计:在美国NCBI网站(http:// www.nebi.nlln.nih.gov)Gene-bank数据库中查到人类vit一1基因的序列和beta一ac血基因的序列，遵循引物设计原则分别设计出vit一1基因和beta一actin基因引物，由上海生工生物技术服务有限公司合成。 3.cDNA制备:取每个RNA样品4闪，加人2.spmoF闪01190(dT)1闪，40U/林1 RNase Inhibitorl林l，10 x RNA PCR Bu氏rZ醉，25nunoFL MgC122.8闪，10nunoFL dNTP 1.5闪，SU/闪AMV Reverse transeriptasel川，无RNase水补足20林l，42℃反应lh，94℃加热10而n终止反应。 4.PCR反应:为确保不同样本之间mRNA表达水平具有可比性，首先进行预实验，确定检测vit一1基因mRNA表达的最佳反应条件和循环次数，以保证实验所选用的循环次数处于DNA片段扩增的指数期。PCR最佳反应条件为94℃305、55℃1205、72℃455，35个循环。 5.RT一PCR产物的半定量分析:取每一样品的PCR扩增产物各10闪，在同一块1 .5%琼脂糖凝胶上进行电泳后在凝胶成像分析系统上进行图像分析，分别得到目的基因与其相应内对照beta一actin基因扩增产物的光密度值，二者的比值作为目的基因mRNA表达水平的半定量指标。结果 一、vit一1基因测序 vit一1基因mRNA的RT一PCR产物由上海博亚生物技术有限公司进行测序，测序结果与Genebank数据库中查到的人类vit一1基因的序列完全匹配。 .二、RT一PCR产物的半定量分析结果 白瘫风患者黑素细胞表达vit一1基因mRNA与表达beta一actin基因mRNA的比值为:0 .419和0 .368。正常对照黑素细胞表达vit一1基因mR-NA与表达beta一aetin基因mRNA的比值为:0.675，0.527和0.520。这初步表明中国白瘫风患者黑素细胞内vit一1基因mRNA表达水平下降。结论中国白瘫风患者黑素细胞内vit一1基因mRNA表达水平下降，提示vit基因mRNA表达水平下降可能与白瘫风发病相关。