1.研究背景膀胱癌（bladder cancer,BC）是全球第十大最常见的恶性肿瘤,90%的膀胱癌类型是尿路上皮癌,又称为移行细胞癌。鳞状癌和腺癌虽然不常见（分别为5%和2%）,但一经发现,多为晚期,死亡率较高。2020年全球估计有573275例新病例和212536人死亡。据估计,2020年美国有81,400例膀胱癌新病例和17980例膀胱癌死亡。在我国,过去十年,膀胱癌的发病率和死亡率也有明显升高。膀胱癌患者男性居多,一般认为与吸烟和职业暴露有关。膀胱癌可分为非肌层浸润性膀胱癌（nonmuscle-invasive bladder cancer,NMIBC）或肌层浸润性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer,MIBC）。在初诊为膀胱癌的患者中,70%为 NMIBC。NMIBC患者采用保留膀胱的治疗策略,如经尿道膀胱肿瘤切除术（TURBT）,然后膀胱内免疫治疗或化疗;MIBC患者接受新辅助化疗和手术切除膀胱。以免疫检查点为基础的免疫治疗也取得了较好的效果。经规范治疗,NMIBC的5年生存率可达90%。但仍有约15-20%的NMIBC,特别是Tis或高级别的T1患者,可进展为MIBC。诊断为T1期膀胱癌的患者中,约10-34%会在5年内死亡。而MIBC的5年生存率只有大约60-70%,pT2N0患者的5年生存率仅为60-70%,pT3-4aN0患者的5年生存率更是只有40-50%。对MIBC即使行膀胱根治性切除术和盆腔淋巴结清扫术,仍有50%的患者最终发生远处转移。近年来,大量用作膀胱癌诊断、监测及预测预后的生物标志物被开发出来,但至今尚无一个类似PSA在前列腺诊断、监测中作用的标志物,可应用于膀胱癌。糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰（post-translation modification,PTM）形式,是聚糖在糖基转移酶作用下连接至肽链的过程,可发生在所有的生物体中,对蛋白质的功能有很大的影响,对肿瘤的恶性转化和转移有重要作用。蛋白质糖基化的两种主要类型是N-糖基化和O-糖基化。N-糖基化使蛋白天冬酰胺侧链上的氮原子与N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）在内质网相连接。N-聚糖继续在高尔基体中进一步加工分化。O-糖基化可使苏氨酸或丝氨酸的侧臂上的氧原子与N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）连接。O-聚糖可在内质网、高尔基体、甚至在细胞质中合成。糖基化异常是癌症的标志。许多肿瘤相关聚糖,如CA19-9、AFP、CEA、PSA等,在肿瘤中异常表达,并在肿瘤进展和转移中发挥重要作用,可用作诊断、监测治疗和预后的标志物。与正常组织相比,肿瘤细胞经常显示异常的糖基化模式,出现新的肿瘤特异性抗原。许多高糖基化的蛋白质,如黏附蛋白或蛋白酶,在癌症转移中发挥重要作用。低糖基化可导致蛋白质的错误折叠,引起内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）,也与癌症的发展和预后密切相关。RibophorinII（RPN2）是是一种高度保守的糖蛋白,仅存在于粗面内质网中,寡糖转移酶复合物（oligo-saccharyl-transferasecomplex,OST）的亚单位,可促进寡糖结合多肽链天冬酰胺残基中N-X-S/T共同基序,参与蛋白质的N-糖基化过程。作为OST的亚基,RPN2表达异常可能会导致OST对蛋白质的糖基化异常,从而影响肿瘤进展。N-糖基化已被证明可增强EGFR和PD-L1等的稳定性,抑制其降解,促进肿瘤细胞增殖和介导免疫逃逸。已有研究发现RPN2跟肿瘤细胞表面受体或免疫检查点糖基化有关。如RPN2可参与乳腺癌表面的CD63和P-糖蛋白的糖基化,促进乳腺癌的进展,增强其耐药性。除了参与蛋白质糖基化,RPN2被报道还可通过其他机制促进肿瘤进展。RPN2可与胶质瘤中GSK-3 β直接结合,抑制GSK-3 β对Wnt信号通路中β-catenin等底物的降解,促进胶质瘤进展及增强其耐药性。RPN2还可通过磷酸化STAT3和NF-κB通路,抑制自噬,促进MMP-9表达,促进肝细胞癌增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化。本研究通过生信分析发现RPN2可在膀胱癌组织中高表达,并在膀胱癌各亚组中有表达差异,是膀胱癌的不利预后因素;其表达差异在临床组织样本免疫组化中得到验证;进一步探讨RPN2对膀胱癌细胞生物学功能的影响、促进膀胱癌进展的机制和其表达的调控的机制,为膀胱癌的诊断、监测和治疗提供新的潜在靶点。2.实验目的1)探讨RPN2在膀胱癌组织中的表达水平、在膀胱癌各亚组中的表达差异和对膀胱癌患者预后的影响。2)探讨RPN2对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭和EMT等生物学功能的影响。3)探讨RPN2对膀胱癌细胞中EGFR和PD-L1糖基化的影响以及对免疫细胞功能的影响。4)探讨RPN2表达被lncRNA LUCAT1/miR-181c-5p轴调控从而促进膀胱癌的进展的机制,为膀胱癌的诊断及诊疗提供潜在靶点。3.实验方法3.1 RPN2在膀胱癌组织中的表达及其预后价值1)选择GEO数据库中的GSE3167和GSE7476数据集,分别用R语言limma包行差异基因分析,获得膀胱癌与正常组织对比的差异基因,并将分析两个数据集获得的差异基因取交集。获得膀胱癌组织与正常组织间的差异基因。通过Cox单因素和多因素分析筛选目的基因。2)选取GEO数据库中的GSE3167、GSE7476、GSE13507、GSE83586和GSE120736共5个膀胱癌数据集和TCGA数据库中的BLCA数据集,分别比较膀胱癌与正常组织、膀胱癌各亚组间RPN2的表达差异。3)选取71名膀胱癌患者的病理组织切片,其中19例有配对的癌旁组织,行免疫组化。行免疫组化后,根据免疫组化染色的强度和阳性细胞的比例评分,来比较膀胱癌组织各亚组中RPN2蛋白的表达差异。4)按照RPN2表达量的中位数,将TCGA-BLCA膀胱癌患者分为RPN2高表达组和低表达组,将年龄、性别、T分期、N分期、M分期、AJCC分期和分级纳入统计分析,对OS和DFS行生存分析、Cox单因素和多因素分析。3.2RPN2对膀胱癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT的影响1)用5637、T24、RT4和J82等4株膀胱癌细胞系,提取蛋白,利Western blotting检测RPN2在4株膀胱癌细胞系中的表达。2)设计并合成RPN2的干扰RNA并转染膀胱癌细胞T24和5637。应用Western blotting检测在膀胱癌细胞T24和5637中siRNA干扰RPN2的效率。3)在膀胱癌T24和5637细胞中敲减RPN2后,采用CCK-8实验检测其增殖能力变化,克隆形成实验检测其克隆形成能力变化,划痕实验检测其迁移能力变化,Transwell实验检测其迁移和侵袭能力变化。4)在膀胱癌T24和5637细胞中敲减RPN2后,采用Western blotting检测在膀胱癌细胞中EMT相关标志物的表达变化。3.3 RPN2对EGFR和PD-L1糖基化和T细胞功能的影响1)在膀胱癌T24和5637细胞中敲减RPN2后,Westernblotting检测细胞中EGFR和PD-L1的变化。2)在膀胱癌T24和5637细胞中敲减RPN2后,Western blotting检测细胞中PI3K、Akt、p-PI3K和p-Akt的变化。3)选取流式分选的CD8+T细胞,与膀胱癌细胞共培养。我们将敲减RPN2的膀胱癌T24和5637细胞和对照组膀胱癌细胞,分别与CD8+T细胞共培养,用ELISA检测培养液中IL-2和INF-γ的浓度。3.4 RPN2可被lncRNA LUCAT1/miR-181c-5p调控促进膀胱癌的进展1)设计并合成miR-181c-5p的抑制剂（anti-miR-181c-5p）和模拟物（miR-181c-5p mimic）。在膀胱癌细胞中转染anti-miR-181c-5p和miR-181c-5p mimic后,应用RT-qPCR检测miR-181c-5p的表达水平。2)将 anti-miR-181 c-5p 和 miR-181 c-5p mimic 转染至膀胱癌细胞后,采用 RT-qPCR检测膀胱癌细胞中RPN2 mRNA的表达水平。3)在膀胱癌细胞中转染anti-miR-181c-5p或miR-181c-5p mimic后,采用Western blotting检测膀胱癌细胞中RPN2蛋白的表达水平。4)敲减膀胱癌细胞中的lncRNA LUCAT1后,采用RT-qPCR检测miR-181c-5p的表达水平。5)敲减膀胱癌细胞中的lncRNA LUCAT1后,采用RT-qPCR检测RPN2 mRNA的表达水平,采用Western blotting检测RPN2蛋白的表达水平。6)进行挽救实验,在膀胱癌细胞中敲减lncRNALUCAT1后,再次敲减miR-181c-5p,用Western blotting检测膀胱癌细胞中RPN2的蛋白表达。7)验证 miR-181c-5p 与lncRNALUCAT1 的直接作用,构建 lncRNALUCAT1 的野生型和突变型（突变型1和突变型2）质粒,将膀胱癌细胞同时转染miR-181c-5p mimic和lncRNA LUCAT1的野生型或突变型质粒,检测其荧光素酶活性。8)验证miR-181c-5p与RPN2mRNA的直接作用,构建含有3’-UTR野生型和突变型（突变型1和突变型2）的RPN2mRNA的质粒,将膀胱癌细胞同时转染miR-181c-5p mimic和3’-UTR野生型或突变型（突变型1和突变型2）的RPN2 mRNA的质粒,检测其荧光素酶活性。4.实验结果4.1 RPN2在膀胱癌组织中的表达及其预后价值1)获得在膀胱癌中高表达和低表达的差异基因,并分别将高表达和低表达的基因求交集,共获得1 10个高表达基因和213个低表达基因。然后分别按每个基因表达量的中位数,将TCGA-BLCA数据集中的膀胱癌患者分为高表达组和低表达组,结合其临床数据,先行Cox单因素和多因素回归分析,获得8个对OS有独立预后意义的差异基因。然后分别行RPN2高低表达组的OS和DFS的生存分析,发现RPN2高表达组和低表达组的患者,其OS和DFS均有统计学差异。确定RPN2为研究的目的基因。2)GSE3167、GSE7476、GSE13507、GSE83586、GSE120736共和TCGA-BLCA中的膀胱癌亚组分析结果显示,RPN2在膀胱癌组织中较正常组织或癌旁组织中高表达,在MIBC、G3级、高级别、AJCC Ⅲ/Ⅳ期和复发性膀胱癌组织中高表达。3)在临床标本的膀胱癌组织中,RPN2蛋白在膀胱癌组织的表达较癌旁组织中明显高升高,在膀胱癌组织的表达较配对癌旁组织中明显高升高,在MIBC中的表达较NMIBC中明显升高,在高级别膀胱癌组织中的表达较低级别膀胱癌组织中明显高升高。4)Spearman相关性分析发现,RPN2表达量与B细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞的浸润程度和EGFR、PD-L1、AKT和mTOR的表达量成正相关,且有统计学意义。5)RPN2高、低表达组的膀胱癌患者,其OS和DFS均具有显著差异。行Cox单因素和多因素回归分析发现,RPN2是OS的独立预后因素。4.2 RPN2促进膀胱癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT1)在各膀胱癌细胞系中,RPN2蛋白表达水平在T24和5637细胞系中表达较高。2)设计并合成RPN2的siRNA。与对照组相比,设计的siRPN2可明显降低膀胱癌T24和5637细胞中RPN2的蛋白表达水平。3)RPN2可促进膀胱癌细胞的增殖能力和克隆形成能力:CCK-8实验表明,敲减RPN2可明显抑制膀胱癌细胞的增殖能力。克隆形成实验表明,敲减RPN2可明显抑制膀胱癌细胞的克隆形成能力。4)RPN2可促进膀胱癌细胞的迁移能力和侵袭能力:划痕实验表明,敲减RPN2可明显抑制膀胱癌细胞的迁移能力。Transwell实验表明,敲减RPN2可明显抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力。5)RPN2可影响EMT相关蛋白的表达:WB实验表明,敲减RPN2可明显下调N-cadherin蛋白和Vimentin蛋白的表达,上调E-cadherin蛋白的表达。4.3 RPN2可促进膀胱癌细胞EGFR和PD-L1糖基化,抑制T细胞功能1)与对照组相比,敲减RPN2的膀胱癌细胞中,EGFR分子量减小,电泳速度变快。2)敲减RPN2后,膀胱癌细胞中PI3K、Akt、p-PI3K和p-Akt降低,且p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的值均显著降低。3)敲减RPN2后,与膀胱癌细胞共培养的CD8+T细胞,培养基中IL-2浓度明显升高,INF-γ浓度也明显升高。4.4 RPN2可被lncRNA LUCAT1/miR-181c-5p调控促进膀胱癌的进展1)在膀胱癌细胞中转染anti-miR-181c-5p后,miR-181c-5p的表达水平显著降低。相反,在膀胱癌T24和5637细胞中转染miR-181c-5pmimic后,miR-181c-5p的表达水平显著升高。2)敲减膀胱癌细胞中的miR-181c-5p后,RPN2mRNA的表达水平明显升高。在膀胱癌细胞中过表达miR-181c-5p后,RPN2 mRNA的表达水平均明显降低。3)敲减膀胱癌细胞中的miR-181c-5p后,RPN2蛋白的表达水平显著升高。相反,在膀胱癌细胞中过表达miR-181c-5p后,膀胱癌细胞中RPN2蛋白的表达水平明显降低。4)在膀胱癌细胞中敲减lncRNA LUCAT1后,miR-181c-5p的表达水平可显著升高。5)在膀胱癌细胞中敲减lncRNALUCAT1后,RPN2mRNA和蛋白的表达水平均显著升高。6)挽救实验发现,在膀胱癌细胞中敲减lncRNA LUCAT1后,RPN2蛋白的表达水平明显降低,再次敲减miR-181c-5p后,RPN2蛋白表达水平明显升高。7)转染miR-181c-5p mimic和lncRNA LUCAT1的野生型的膀胱癌细胞中,其荧光素酶活性明显降低,而转染miR-181c-5p mimic和lncRNA LUCAT1的突变型的膀胱癌T24和5637细胞中的荧光素酶活性也降低,但是与转染miR-181c-5p mimic和lncRNA LUCAT1的膀胱癌细胞相比,其降低幅度小。证明miR-18 1c-5p 可与 lncRNA LUCAT1 直接结合。8)转染miR-181c-5p mimic和3’-UTR野生型RPN2 mRNA的膀胱癌细胞中,其荧光素酶活性明显降低,而转染miR-181c-5p mimic和3’-UTR突变型RPN2 mRNA的膀胱癌T24和5637细胞中的荧光素酶活性也降低,但是与转染miR-181c-5p mimic和3’-UTR野生型RPN2 mRNA的膀胱癌细胞相比,其降低幅度小。证明miR-181c-5p可与RPN2 mRNA的3’-UTR端直接结合。5.实验结论1)RPN2作为癌基因,在膀胱癌组织中高表达,且MIBC、高分期、高级别、转移和复发的患者,其表达水平较高,其高低表达组患者的OS和DFS均有显著差异,可作为OS的独立预后因素。2)功能研究证实RPN2可促进膀胱癌细胞的增殖能力、克隆形成能力、迁移和侵袭能力。3)RPN2可促进膀胱癌细胞中EGFR和PD-L1的糖基化,激活PI3K/Akt通路,可抑制CD8+T细胞功能。4)RPN2在膀胱癌中的表达水平可被lncRNA LUCAT1/miR-181c-5p轴调控。