鸡CAST基因cDNA的克隆、组织表达及其生物信息学分析

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钙蛋白酶系统在细胞内普遍存在,主要包括钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白,其参与机体生长与代谢过程,尤其在肌原纤维更新和宰后肉嫩化中扮演重要角色。钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin,CAST)是一种内源性的、需Ca2+激活的钙蛋白酶抑制剂,可抑制肌肉蛋白质降解;屠宰后可抑制钙蛋白酶的活性,降低蛋白质水解,从而影响肌肉的生长和嫩度,因而CAST基因将极有希望成为研究畜禽肌肉生长和肉质性状的候选基因。以地方品种四川山地乌骨鸡为试验材料,克隆获得了鸡CAST基因的全编码区序列2361bp,共编码761个氨基酸,与GenBank上红色原鸡CAST基因mRNA序列(XM424713)比对,发现本试验所得序列与原鸡的一致性为99.9%。有两个碱基突变:第308位点存在T→C碱基突变,486位点存在T→C碱基突变,且第308位点的T→C碱基突变造成了第112位点Leu→Pro的氨基酸突变,而第486位点的T→C碱基突变没有造成氨基酸的突变。经生物信息学分析,鸡CAST是一个具有2个跨膜螺旋和5个疏水区域的蛋白,相对分子量为70.48kDa,等电点pI为5.49。其氨基酸序列具有78个磷酸化位点。该蛋白质的二级结构含有alpha螺旋、延伸片断和随机螺旋三种结构,且随机螺旋占多数。该蛋白与钙蛋白酶抑制蛋白具有结构和功能上高度相似性。以地方品种四川山地乌骨鸡、藏鸡和培育优质鸡“大恒”S01系为试验材料,采用SYBR greenⅠ定量PCR分析CAST基因在1日龄和84日龄两个时间点品种间的表达差异,同时分析了四川山地乌骨鸡胚胎期(第9天和第15天)、1日龄和84日龄等4个时间点CAST基因表达的组织差异,以及腿肌、胸肌、脑、心脏、肝脏、腹脂和皮脂组织中CAST基因表达量的发育性变化。结果表明:CAST基因在鸡不同生长发育阶段都有表达,并且在不同阶段各有优势表达组织,同一组织中也有表达的优势时间点。CAST mRNA在整个发育阶段的心组织均有较高水平表达;肌肉组织在胚胎期表达量较低,而在出生后表达量较高,为表达优势组织。四川山地乌骨鸡各组织中CASTmRNA表达水平存在明显的发育性变化:肌肉组织在第42天表达量达到最高点,随后随着日龄增加表达量降低。CAST在1日龄藏鸡和10周龄大恒优质鸡各组织中也有表达,并且在肌肉组织中的高表达受品种的影响。
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