论文部分内容阅读
癌症,又称恶性肿瘤,是一类严重威胁人类生命和健康的重要疾病。以顺铂、卡铂和奥沙利铂为代表的铂类抗肿瘤药一直是恶性肿瘤化疗的首选药物,在肿瘤治疗中占有重要的地位。尽管铂类抗肿瘤药物的研发已取得很大进展,但由于其缺乏对肿瘤细胞的选择性,仍会带来一系列严重的毒副作用。单克隆抗体能特异性识别肿瘤细胞,但其细胞杀伤能力较低,抗肿瘤效果有限,临床上主要是与非特异性的化学药物联合使用。近年来,肿瘤的靶向性治疗已成为了肿瘤领域的研究热点。采用化学方法将具有靶向性的抗体或抗体片段与具有良好药理活性的小分子铂类抗肿瘤药物进行连接,制备抗体药物偶联物,既能特异性的识别肿瘤细胞,又能高效地杀伤靶细胞,降低药物的毒副作用,从而可以达到高效低毒的治疗目的。本论文以顺铂和奥沙利铂为模型药物,设计并制备了两类铂类化合物,一类为四价铂化合物,以氨基、乙二胺和1R,2R-环己二胺为配基,氯离子或草酸根离子为离去基团,轴向对称引入可用于进一步修饰的羧酸根基团。另一类为二价铂化合物,以氨基和1R,2R-环己二胺为配基,谷氨酸根离子为离去基团引入氨基,与溶酶体酶可降解的缬氨酸-瓜氨酸二肽一端相连接,另一端引入羧酸根基团,用于与靶向载体连接。采用红外光谱、核磁、质谱及元素分析对化合物进行了结构表征,并采用CCK-8试剂盒测定了化合物对三种乳腺癌细胞,MCF-7, MDA-MB-231及SK-BR-3的体外抗肿瘤活性。与顺铂和奥沙利铂相比,铂化合物的抗肿瘤活性明显降低,对SK-BR-3细胞几乎不表现出生长抑制作用。本论文针对肿瘤细胞表面高度表达的Her2抗原,选用商业化抗体—曲妥珠单抗作为靶向载体,与上述铂类前体药物进行偶联,制备抗体药物偶联物。采用高效液相色谱、原子吸收光谱、BCA试剂盒对偶联物进行鉴定,计算药物／抗体比值。本论文所制备偶联物药物／抗体比值均在4-7范围内,为抗体药物偶联物药物／抗体比值的理想数值。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定了抗体偶联前后对Her2抗原和靶细胞SK-BR-3的亲和力变化,并通过荧光显微镜观察偶联物对Her2阳性表达细胞SK-BR-3及Her2阴性表达细胞MDA-MB-231的识别能力。在与铂物分子化学偶联后,曲妥珠单抗对Her2抗原及靶细胞的亲和力较偶联前有所下降,但也基本保持了其对Her2抗原和靶细胞的结合能力。偶联物与曲妥珠单抗一样均能识别位于细胞膜上的Her2抗原,特异性结合到Her2阳性表达的SK-BR-3细胞表面,而不与Her2阴性表达的MDA-MB-231细胞发生结合。采用CCK-8试剂盒测定了偶联物对三种乳腺癌细胞,MCF-7, MDA-MB-231及SK-BR-3的体外抗肿瘤活性。结果表明,偶联物对SK-BR-3细胞的细胞毒性显著提高,与顺铂的作用能力相当,且较奥沙利铂细胞毒性更强。而对于Her2蛋白表达含量低的乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231,抗体四价铂偶联物在最高给药剂量的肿瘤细胞抑制率仍小于30%。利用流式细胞仪进行细胞周期检测,发生抗体-四价偶联物对SK-BR-3细胞的阻滞主要发生在G2/M期,而抗体-二价偶联物对SK-BR-3细胞的阻滞主要发生在S期。通过上述实验研究表明：曲妥珠-铂药偶联物能区分靶细胞和非靶细胞,特异性结合到Her2高表达的乳腺癌细胞表面,表现出较好的细胞毒性,降低对非靶细胞的损伤,为铂类抗肿瘤药物的靶向设计提供了一种新的思路。