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二氯喹啉酸(Quinclorac),是德国BASF公司于1983年开发的一种激素型喹啉羧酸类除草剂,主要用于防除稻田稗草和部分阔叶类杂草,具有用量少、残效期长、施用期宽等优点,是稻田常用除草剂。由于二氯喹啉酸显弱酸性(pKa 4.34),在酸性土壤环境中不易降解,易对后茬敏感作物烟草(Nicotiana tabacum L.)产生药害。目前,关于二氯喹啉酸对烟草的药害机理,从形态、生理特性方面研究较多,而从分子水平上研究尚少,因此有必要借助分子生物学手段,从基因表达、调控及信号转导等分子水平进行深入研究,揭示药害的分子机理,为缓解二氯喹啉酸药害提供科学理论依据。本文主要针对二氯喹啉酸土壤残留为何会对后茬作物烟草产生胁迫、胁迫下烟叶的生理响应以及差异蛋白表达等方面开展了研究,结果如下:⑴二氯喹啉酸在江西烟区水稻田土壤环境中的消解动态研究表明,二氯喹啉酸在土壤中的降解符合一级化学反应动力学方程C=Coe-kt;在50%二氯喹啉酸WP 375a.i.g/hm2(推荐剂量)施药剂量时,消解动态方程为C=0.176e-0.061t(R2=0.9144),半衰期为11.36 d;在50%二氯喹啉酸WP 562.5 a.i.g/hm2(1.5倍推荐剂量)施药剂量时,消解动态方程为C=0.249e-0.0314t(R2=0.7155),半衰期为22.07 d。江西烟区土壤酸性较高,二氯喹啉酸不易降解,在施用过二氯喹啉酸除草剂的水稻田,土壤中二氯喹啉酸残留必将对后茬烟草产生胁迫,致使烟草产生畸形。该研究可为二氯喹啉酸在江西烟区的合理利用提供科学理论依据。⑵二氯喹啉酸胁迫下烟叶光合作用、物质合成与代谢、防御酶系统等生理活动发生了一些变化应答逆境胁迫。二氯喹啉酸胁迫下,烟叶中可溶性糖、可溶性蛋白质、脯氨酸等渗透调节物质含量以及丙二醛(MDA)含量的变化规律不同,烟叶主要通过积累脯氨酸来调节渗透平衡,抵抗二氯喹啉酸对烟株的伤害,因此脯氨酸可作为烟草抗二氯喹啉酸除草剂胁迫的指标。烟叶中防御系统酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性均下降,SOD、CAT比POD、APX敏感。二氯喹啉酸1.0×10-22 mg/kg胁迫下的烟叶,光合速率、蒸腾速率、气孔导度和胞间CO2浓度与正常烟叶相比差异显著,二氯喹啉酸影响了烟叶的光合作用,使烟叶生物合成受阻,导致烟株生长缓慢。⑶利用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术对二氯喹啉酸胁迫下的烟叶进行蛋白质组学定量研究,并对所获得差异表达蛋白进行生物信息学分析。iTRAQ技术共鉴定5275种定量蛋白,416种差异蛋白,其中表达上调的252种,表达下调的164种。基因本体(Gene Ontology,GO)GO分析结果显示:差异表达蛋白主要富集于质体、类囊体、细胞质、胞外区、细胞内、质膜、核、蛋白复合物、线粒体等细胞组成,参与了离子结合、氧化还原酶活性、RNA结合、跨膜转运蛋白活性、DNA结合、糖苷键-水解酶活性等分子功能,分别涉及到生物合成、小分子代谢、胁迫应答、输导、细胞氮复合物代谢、光合作用、分解代谢、前体代谢产物和能量的产生等生物过程。京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路主要富集于碳代谢(15.12%)、氨基酸生物合成(10.47%)、光合作用(9.88%)、核糖体(8.72%)、氧化磷酸化(6.98%)等。STRING表明,差异表达蛋白互作网络由光合作用、物质的合成与代谢、防御胁迫、信号传导、细胞转运及定位等构成,各蛋白间通过多条作用通道进行调节。⑷为了验证iTRAQ蛋白质组学定量技术的鉴定结果,随机选择了7种差异表达蛋白进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证。结果表明:mRNA与蛋白质表达水平并不一致。本研究结果为解析二氯喹啉酸对烟草的药害机理及植物的抗逆机制和缓解药害提供一些理论依据。