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目的:阐明当归补血汤调控红细胞生成的作用通路。方法:一、当归补血汤的网络药理学研究。1)基于文献调研和中医药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/,Version 2.3)获取当归与黄芪的化学成分;2)基于生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18这两个指标,筛选得相关药效成分,同时加入当归补血汤中不符合筛选标准但含量高或具有显著活性的成分;3)利用STITCH(http://stitch.embl.de/)、Swiss Target Prediction(Swiss,http://swisstargetprediction.ch/)、Similarity ensemble approach(SEA,http://sea.bkslab.org/),获得与相关药效成分有关的靶基因;4)利用ClusterProfiler包对靶基因相关的疾病进行预测,寻找与血液系统疾病相关的基因,基于KEGG、GO数据库,利用ClusterProfiler R包进行功能注释。二、骨髓基质细胞在当归补血汤调控红细胞生成中的作用研究。1)MTT法优化体外培养骨髓基质细胞时的当归补血汤浓度;2)利用CD71、TER119标记骨髓细胞,运用流式细胞术检测当归补血汤对红系相关细胞影响;3)通过BFU-E、CFU-E检测造血祖细胞的增殖分化能力;4)通过鹅卵石形成实验检测骨髓基质细胞在其中起到的作用;5)转录组学分析当归补血汤对小鼠骨髓基质细胞基因表达的影响,预测骨髓基质细胞发挥作用的途径,同时使用Q-PCR验证。三、当归补血汤促进骨髓基质细胞分泌细胞因子的研究。1)优化当归补血汤-条件培养基的制备方法以及最适给药浓度;2)使用3K超滤管将条件培养基分为大分子组与小分子组,使用SDS-PAGE进行质量控制,同时运用细胞增殖实验检测大、小分子对骨髓基质细胞体外培养的影响;3)通过Q-PCR法检测相关细胞因子的基因表达变化,筛选出符合要求的细胞因子;4)运用流式细胞术检测条件培养基大分子对红系相关细胞凋亡的影响;5)利用Q-PCR与Western Blot分别从基因和蛋白水平检测条件培养基大分子对凋亡相关基因与蛋白的影响。四、当归补血汤促幼红细胞岛形成的研究。1)流式细胞术检测小鼠外周血中网织红细胞的比例,以此判断当归补血汤的药效以及确定取材时间;2)流式细胞术检测当归补血汤对小鼠体内红系相关细胞中的早、中、晚幼红细胞的比例影响;3)通过BFU-E、CFU-E检测小鼠体内造血祖细胞的增殖分化能力;4)HE染色、免疫荧光检测当归补血汤对小鼠幼红细胞岛的影响;5)Q-PCR从基因水平检测幼红细胞岛相关基因的变化。结果:一、当归补血汤网络药理学研究。1)共获得212种化学成分,基于OB≥30%、DL≥0.18这两个指标筛选得当归补血汤17种潜在的药效成分,后加入15种不符合筛选指标但含量高或具有显著活性的成分,共得32种药效成分。2)通过TCMSP、STITCH、SEA、SWISS数据库对这32种药效成分的作用靶点进行预测,找到1217种相关基因。3)利用ClusterProfiler包对这些基因的功能进行注释,发现与造血系统疾病相关的基因有81种。4)通过ClusterProfiler包对造血相关基因进行GO和KEGG功能注释发现这些基因与单核细胞增殖、粘附、凋亡、Cytokine activity、PI3K-AKT通路等功能有关。二、骨髓基质细胞在当归补血汤调控红细胞生成中的作用研究。1)体外实验表明骨髓基质细胞数目与当归补血汤给药量之间呈现剂量效应关系,0.5、1、2、4 mg/mL时与对照组相比骨髓基质细胞数目显著增多,4 mg/mL时骨髓基质细胞数目最多,而8 mg/mL时数目降低,呈现一定的毒副作用,为避免毒副作用,后续选择给药浓度为2 mg/mL;2)流式细胞术检测发现,与对照组相比,当归补血汤组早、中期幼红细胞的比例显著上升(P值分别为P=0.0016,P=0.0319),说明当归补血汤可以促进红系相关细胞向早、中期幼红细胞发育成熟;3)在BFU-E、CFU-E实验中,当归补血汤组细胞克隆数目显著上升(分别为P=0.0067,P=0.0041),说明当归补血汤可以促进造血祖细胞向下游红系细胞增殖分化;4)通过鹅卵石实验,将骨髓细胞在有(无)骨髓基质细胞的条件下与当归补血汤共培养,发现当与骨髓基质细胞共培养时,细胞克隆数目显著增加,说明骨髓基质细胞在其中发挥重要作用;5)转录组分析结果表明当归补血汤组与对照组相比,ECM-receptor interaction,PI3K-AKT,Focal adhesion等通路发生变化。这些通路均与粘附有关,其中涉及COL6A3、TNN、THBS1、ITGA2B、PI3K、AKT、CCND2等基因。与网络药理学分析取交集,ECMPI3K-AKT-CCND2是共有的;6)通过Q-PCR实验验证了COL6A3、TNN、THBS1、ITGA2B、PI3K、AKT、CCND2等基因表达显著增加。三、当归补血汤促进骨髓基质细胞分泌细胞因子的研究。1)条件培养基组与对照组相比,可显著提高骨髓基质细胞的数目(P=0.0387);2)SDS-PAGE实验确保经过3K超滤管超速离心后将大、小分子分离。与对照组相比条件培养基大分子组能够显著提高骨髓基质细胞数目(P=0.0085);3)流式细胞术发现红系相关细胞的早期凋亡比例在条件培养基大分子组培养后显著下降(P=0.047);4)Q-PCR检测了FGF、MYDGF、FLT3、SCF这四个细胞因子的基因,发现FGF、MYDGF、FLT3的表达显著上调;5)Q-PCR验证了凋亡相关基因,条件培养基大分子组BCL-2、BCL-XL显著上调,BAX、BAD显著下调。WB实验验证了BCL-2与BAX,给药后,BCL-2/BAX的比例显著上调(P=0.0148)。四、当归补血汤促幼红细胞岛形成的研究。1)当归补血汤连续给药15天后,流式细胞术发现小鼠外周血中网织红细胞显著升高(P=0.039);2)早、中期幼红细胞的比例显著上升(P值分别为P=0.017,P=0.01);3)BFU-E、CFU-E实验中,当归补血汤组细胞克隆数目显著上升(分别为P=0.028,P=0.003),说明造血祖细胞可能是当归补血汤的潜在作用靶点;4)股骨HE染色以及免疫荧光检测,均显示当归补血汤组的幼红细胞岛数量显著上升(P值均为P<0.0001);5)Q-PCR检测了VCAM-1、ITGA5、ICAM-4、ITGA4、ITGB1、EMP等基因,其中VCAM-1与ITGB1的表达显著上调,而它们与幼红细胞岛中巨噬细胞和幼红细胞的粘附密切相关。结论:对当归补血汤进行网络药理学分析后,预测得造血相关基因与单核细胞增殖、粘附、凋亡、PI3K-AKT通路等功能有关。当归补血汤通过骨髓基质细胞间接促红细胞生成,是通过ECM-PI3K-AKT通路中的COL6A3、TNN、THBS1、ITGA2B、PI3K、AKT、CCND2等基因发挥作用的。当归补血汤能够通过促进骨髓基质细胞分泌髓源性生长因子来抑制细胞凋亡。小鼠给药当归补血汤后,可促进骨髓中幼红细胞岛的形成,这为其骨髓造血提供了良好的环境。