自20世纪90年代以来，随着微电子学、光电技术、纳米科技的飞速发展，科学的进步到了一个新的起点，不但要求对整体特征的正确理解，同时要求对个体间差异的详细阐述。人们力图在单分子水平上捕捉细胞生命活动的细节；力图实时检测化学反应过程中单分子的形态和行为，克服集团平均研究的缺陷，在更深入的层次揭示化学反应的规律；力图了解单个分子本身的物理特性以及与周围环境的相互作用，揭示物理本源。在这样的大环境下单分子探测科学应运而生。 本论文工作按照国家973课题“活细胞单分子实时视见研究”的要求，重点是寻求“可实时视见地观察细胞生命活动过程中的单分子之间的相互作用”的光学探测途径。论文对当今国际上单分子研究的现状、探测方法、在生物学上的新兴应用和发展前景进行了较全面的调研及评述。围绕单分子全内反射荧光探测技术，开展了三个方面的研究工作。一，全内反射成像理论的研究。二，全内反射荧光探测系统的建立及应用研究。三，超短脉冲下的双光子吸收截面探测系统的建立以及应用研究。概括起来，取得了以下几个方面的创新性进展： 1.隐失场偏振理论的发展。(a)对不同偏振光入射下的隐失场偏振特性进行了严格的推导，并得到了隐失场激发下的荧光发射各向异性的定量分布；(b)基于隐失场的偏振特性，提出了结合落射式荧光和全内反射荧光两种成像方式，通过对荧光强度的数值分析来确定单分子三维取向的新思路。我们的方法具有光路易于调节、数据处理简单的特点。 2.全内反射超分辨理论的发展。(a)我们分析了将驻波激发引入到全内反射成像方法中后，各种入射条件对成像分辨率的影响，给出了提高分辨率的最优化原则；(b)提出利用隐失场独特的纵向成像特性，可以在单分子的荧光探测中直接快速的确定单分子荧光团间的纵向间隔和每个荧光团的纵向绝对位置，即实现单分子的纵向超分辨荧光成像。 3.建立了一套物镜型全内反射荧光成像系统，并解决了系统重要参数的标定问题，自行设计方案对系统分辨率、系统探测效率和光强计算等进行了细致的定量测量和分析。 4.以此系统为平台进行了离体荧光素分子的探测，实现了平均精度为23nm的单分子空间定位。并首次在没有配体EGF刺激的情况下，研究了CHO活细胞内单个EGFR蛋白分子的膜动力学行为。不仅观察到量子态淬灭的单分子典型特性，还观察到“两步阶跃”的动态行为，这将为研究EGFR的二聚化机制提供新的数据。 5.建立了一套790nm/13fs超短脉冲激发下的双光子吸收截面的测量装置，并首次对一种新型的对称型芴类有机染料进行了测量，结果显示其具有与非对称型芴类衍生物相同量级的大的吸收截面。以往双光子有机合成理论认为芴类染料的大的双光子吸收截面源于非对称型取代基之间的电荷转移，我们的测量则显示可能存在其它吸收机制，为研究双光子有机材料提供了重要参数。该系统同时为分子相互作用的荧光共振能量转移(FRET)光谱研究奠定了实验基础。