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胡萝卜作为首先通过组织培养获得体细胞胚的植物,在研究植物胚胎发育过程中一直发挥着重要的作用。植物体细胞胚发育过程与合子胚发育过程非常相似,因此可以借助体细胞胚培养这一体系来研究植物胚胎发育过程中的分子事件。已有研究表明,植物激素生长素(Auxin)和脱落酸(Abscisic acid,ABA)在植物胚根发生和生长发育过程中有重要的调控作用。
DR5是利用GH3基因启动子人工构建的一个片段,它被用作报告基因的启动片段,来指示植物生长素合成运输规律。Dc3基因是胡萝卜晚期胚胎丰富蛋白(LEA)基因家族的一员,已有研究表明该基因的表达受ABA的诱导调控,其启动子含有特定的ABA应答元件(ABA Response Element)。本研究拟利用DR5和Dc3基因启动子的部分片段研究胡萝卜胚胎发育过程中生长素和ABA的时空特性,为进一步认识植物激素调控植物胚胎发生的分子机制奠定基础。
本实验分别选取Dc3基因启动子上+26到-229的255bp序列以及+26到-525的551bp序列,构建带有报告基因GUS和GFP的植物表达载体pCAMBIA-Dc3p255-GUS、pCAMBIA-Dc3p255-GFP、pCAMBIA-Dc3p551-GUS和pCAMBIA-Dc3p551-GFP,用于指示胡萝卜胚胎发育过程中内源ABA合成运输规律。同时,构建表达载体pCAMBIA-DR5-GUS和pCAMBIA-DR5-GFP,用于指示胡萝卜胚胎发育过程中内源生长素合成运输规律。
利用农杆菌介导转基因技术将植物表达载体pCAMBIA-DR5-GUS、pCAMBIA-DR5-GFP、pCAMBIA-Dc3p255-GUS、pCAMBIA-Dc3p255-GFP、pCAMBIA-Dc3p551-GUS和pCAMBIA-Dc3p551-GFP分别转化胡萝卜下胚轴,获得相应的转基因植株,对转基因植株进行GUS组织化学染色以及GUS定量分析,结果表明:DR5::GUS主要在胡萝卜胚的茎生长点、维管组织以及主根和侧根根尖表达;并在2,4-D处理后表达明显增强;Dc3p551::GUS的表达主要在胡萝卜胚的外胚层细胞中表达,其中在胚根发生区、下胚轴发生区以及子叶发生区表达很强烈;Dc3p255::GUS在胡萝卜胚中表达很弱;ABA、7%蔗糖和高盐浓度(100 mmol/LNaCl)处理下,Dc3p551::GUS和Dc3p255::GUS的表达均有所增强;另外结果也显示,Dc3p551对处理的反应比Dc3p255敏感。荧光检测结果显示:DR5::GFP在胚胎中表达很弱,2,4-D处理后表达明显增强;Dc3p551::GFP的观测结果与Dc3p551::GUS比较一致,主要在胡萝卜胚的外表层细胞中表达。
以上的结果表明:利用DR5驱动下GUS和GFP的表达可以研究胡萝卜胚胎发育不同时期生长素的合成和变化规律,而Dc3p551驱动下GUS和GFP的表达较Dc3p255效果明显,并与内源ABA合成存在一定相关性,由此可以利用该启动子驱动下GUS和GFP的表达来研究胡萝卜胚胎发育过程中ABA的合成和变化规律。