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目的:谷氨酸N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-Methyl-D-Asparate Receptor, NR)广泛参与神经突触发育及可塑性、学习记忆、缺血性脑损伤和癫痫等生理病理过程,在中枢神经系统及其损伤过程中起着重要作用。目前己知的NR阻断剂或拮抗剂几乎是人工合成的小分子药物,其特点是容易通过血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB);但其缺点是作用选择性低、常引起严重的毒副作用:如意识模糊、焦虑不安、幻觉等,并且难以超早期用药,因此难以进入临床。NR1是NR的基本组成部分和功能亚单位,具有NR绝大部份的电生理和药理学特性。抗转铁蛋白受体(transferrin recptor, TfR)单克隆抗体OX26被认为是迄今最有前途的脑转运载体,NR1抗体借助TfR可能可以透过血脑屏障在中枢神经系统中发挥干预治疗作用。因此NR1-TfR重组基因口服疫苗有望成为超早期防治脑缺血再灌注损伤、应激、疼痛等的可行方法之一。本研究拟用前期实验构建的NR1-TfR单克隆表位的优势克隆融合蛋白表达载体pcDNA3.1-NR1/TFR(vector-S)制备NR1-TfR重组基因表位疫苗,SD大鼠口服NR1-TfR重组基因表位疫苗后研究该疫苗在正常大鼠体内的免疫反应。 方法:(1)鉴定vector-S在真核细胞HEK293内正确表达:vector-S转染细胞HEK293,细胞免疫荧光和western-blot分析细胞表达产物,判断vector-S在HEK293细胞内的正确表达;(2)制备NR1-TfR融合表位疫苗:vector-S经电穿孔方法转入减毒鼠伤寒沙门杆菌(SL7207),经Amp抗性筛选、基因测序确定vector-S成功转入SL7207内,由此获得含vector-S的细菌SL7207(命名为SL7207-S)。OD600≈0.8时运用平板菌落计数方法计数SL7207-S的细菌含量,以此制备0.5X109cfu/ml、1X109 cfu/ml疫苗单位的口服疫苗;(3)研究NR1-TfR融合表位疫苗在SD大鼠体内的免疫反应:SD大鼠按实验要求经灌胃法口服疫苗,两周内共免疫四次。在此期间观察各组大鼠生长状态,有无腹泻、死亡等现象。取小肠组织(空肠)进行免疫组织化学分析肠道粘膜免疫反应;以HEK293稳定表达的vector-S蛋白作为已知抗原,细胞免疫荧光分析检测血清和脑脊液中抗体的表达。口服免疫一个月后检测抗体在体内持续存在的情况。 结果:1)以商品化抗体NR1、OX26作为一抗,细胞免疫荧光检测转染了vector-S的细胞HEK293可显示红色荧光;western-blot检测其细胞产物在marker2KD-8KD范围内见有目的条带;2) SL7207-S菌种质粒S经基因测序证实其氨基酸序列与vector-S序列一致,平板菌落计数当0D600≈0.8时SL7207-S细菌含量为1.6X107cfu/ml;3)各组大鼠口服NR1-TfR疫苗后生长状态良好,未见腹泻、死亡等现象;4)小肠免疫组织化学结果示空白组肠道粘膜细胞内无棕色物质表达,而NR1-TfR-1组(0.5X109cfu/ml)、NR1-TfR-2组(1X109cfu/ml)均有棕色物质表达;5)细胞免疫荧光结果显示空白对照组大鼠血清、脑脊液作为一抗时HEK293未显示出红色荧光;NR1-TfR-1组、2组血清作为一抗时HEK293均显示出红色荧光;NR1-TfR-1组脑脊液作为一抗时HEK293无红色荧光而NR1-TfR-2组显示出红色荧光,6)免疫一个月后重复检测方法显示NR1-TfR-2组肠道粘膜细胞内仍有棕色物质表达;NR1-TfR-1组血清作为一抗HEK293红色荧光显示较弱,而NR1-TfR-2组血清、脑脊液作为一抗HEK293红色荧光仍明显存在。 结论:1)vector-S在真核细胞HEK293内能正确表达其目的蛋白,符合后续动物实验设计要求;2)成功获得SL7207-S菌种并制备所需的两种疫苗单位的口服疫苗;3)NR1-TfR口服疫苗在SD大鼠体内口服安全,无明显的细菌毒副作用;4)NR1-TfR重组疫苗成功启动SD大鼠肠道粘膜免疫系统;5)两种浓度的口服疫苗均能诱导大鼠产生循环抗体anti-NR1抗体,1x109cfu/ml的NR1-TfR重组疫苗产生的目的anti-NR1抗体可透过血脑屏障进入脑脊液;6)anti-NR1抗体在肠道粘膜细胞、血清和脑脊液内至少持续存在一个月以上。