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背景:氧化铈纳米材料(CNPs)因为其抗氧化性能,现目前已经有大量的研究用于各种疾病的治疗,特别是肿瘤的治疗。目前的研究主要是氧化铈纳米材料(CNPs)的细胞毒性,可以杀伤肿瘤细胞,限制肿瘤的侵袭,也可以增加肿瘤细胞对放疗的敏感性。一些高分子聚合物可以通过锚定在氧化铈的表面,增加氧化铈的生物学性能,提高杀伤肿瘤细胞的能力,而对正常的细胞和组织没有什么影响。但是以上研究均是在较高浓度氧化铈纳米材料(CNPs)(≥10μg/ml)作用下产生的生物学效应,主要是在动物体内得出的实验结果,对人体来说,浓度太高,可能会产生相应的一些副作用,很难应用于临床,然而低浓度的氧化铈纳米材料(CNPs)(≤1μg/ml)是否对肿瘤细胞产生影响,包括肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移等,目前尚未有报道。在本研究中,我们发现通过阿伦磷酸钠将PEG600锚定在氧化铈纳米材料表面,可以增加氧化铈纳米材料的稳定性,而且低浓度(0.01μg/ml)的CNPs-AL-PEG600可以通过活化AKT/ERK信号通路,促进肝癌细胞的增殖,为氧化铈纳米材料治疗肿瘤的生长提供了新的有意义的信息。目的:1、低浓度氧化铈纳米材料(CNPs)可以促进肝癌细胞增殖;2、低浓度氧化铈纳米材料(CNPs)通过活化AKT/ERK信号通路促进肝癌细胞增殖。方法:1、细胞培养:将冻存在本实验室液氮罐中的肝癌细胞Hep G2、Huh7、7721、HCT116、MCF-7以及U2OS复苏,复苏后用含10%胎牛血清的DMEM在37℃、5%CO2的细胞培养箱培养;2、细胞增殖实验:用CCK-8法检测细胞增殖。将对数生长期的六种肿瘤细胞Hep G2、Huh7、7721、HCT116、MCF-7以及U2OS配制成1×104/ml单细胞悬浊液,将每种细胞分为六组,分别加入浓度为0、0.005、0.01、0.05、0.1、1μg/ml的纳米材料,接种于96孔板中,在37℃、5%CO2的细胞培养箱培养24小时。24小时后取出96孔板,每个孔中加入CCK-8试剂10μl,继续孵育2小时后,用酶标仪检测450nm处各孔的吸收度(OD值),测3次,取平均值;3、实时荧光定量PCR检测与凋亡相关的基因Bcl-2以及Bax m RNA的表达:肝癌细胞Hep G2、Huh7、7721经低浓度氧化铈纳米材料(CNPs)处理24小时后,用Trizol法提取细胞总RNA,用核酸浓度测量仪测浓度,根据Ta Ka Ra的RT-PCR试剂盒说明书,两步法逆转录合成c DNA,按组分配制PCR反应液,进行q RT-PCR反应,内参为GAPDH,Bcl-2基因上游引物:ATCg CCCTg Tgg ATg ACTg Ag T,下游引物:g CC Agg Ag AAATCAAACAg Agg C;Bax基因上游引物:TCAgg ATg Cg TCCACCAAg AAg,下游引物:Tg Tg TC CACgg Cgg CAATCATC;反应条件为:95℃,1min;95℃,10s;60℃,15s;72℃,30s,重复40次。最后进行统计学分析;4、基因微阵列分析:将Hep G2细胞接种于6孔板中,分为2组,每组3个复孔,分别为未给予氧化铈纳米材料处理的对照组和给予低浓度(0.01μg/ml)氧化铈纳米材料处理的实验组,在37℃、5%CO2的细胞培养箱培养24小时后,用PBS冲洗6孔板,每孔细胞用Trizol处理后,提取总RNA,转移到EP管中,在-80°C冰箱中保存。将标本送于上海其明信息技术有限公司做检测;5、基因分析和信号通路分析:由上海其明信息技术有限公司完成;6、免疫印迹实验:将浓度为0.01μg/ml氧化铈纳米材料与肝癌细胞Hep G2共孵育,分别提取共孵育0.5h、1h、2h的蛋白,以未用氧化铈纳米材料刺激的肝癌细胞Hep G2中提取的蛋白为对照,分别检测AKT,p AKT,ERK和p ERK抗体在不同时间段的表达量,内参为GAPDH;7、裸鼠皮下成瘤实验:购买10只6-7周龄裸鼠,随机分为2组并称体重,1组为对照组,1组为实验组。将1×106Hep G2细胞重悬于100μl PBS中,然后皮下注射两组裸鼠的右侧腹股沟。第二天开始,每隔一日在实验组裸鼠腹腔内注射剂量为0.01mg/kg的氧化铈纳米材料(CNPs),对照组注射同等剂量的PBS。30天后处死裸鼠,取下瘤体称重;8、统计学分析:用平均值±标准差表示计量资料数据,用Graph Pad Prism5软件进行统计学分析,两组间的差异比较采用t检验,差异性检验水准设为P<0.05。结果:1、低浓度氧化铈纳米材料(CNPs)促进肝癌细胞增殖;2、低浓度氧化铈纳米材料(CNPs)减少肝癌细胞的凋亡;3、低浓度氧化铈纳米材料(CNPs)通过活化AKT/ERK信号通路促进肝癌细胞增殖;4、在体内低浓度氧化铈纳米材料(CNPs)促进肿瘤生长。结论:1、通过CCK-8实验证实,浓度为0.01μg/ml的CNPs-AL-PEG600促进肝癌细胞增殖;2、CNPs-AL-PEG600实验组细胞里凋亡相关基因Bcl-2/Bax比值较对照组升高,表明CNPs-AL-PEG600通过减少细胞凋亡途径来促进肝癌细胞增殖;3、基因芯片分析,CNPs-AL-PEG600可能是通过活化AKT/ERK信号通路促进肝癌细胞增殖;4、WB实验证实CNPs-AL-PEG600是通过活化AKT/ERK信号通路促进肝癌细胞增殖;5、在小鼠体内实验证实浓度为0.01mg/kg的CNPs-AL-PEG600促进肿瘤生长。