人Ⅰ型丙氨酸氨基转移酶是人体内一种以磷酸吡哆醛为辅基的氨基转移酶,在体内催化氨基在丙氨酸和谷氨酸之间转移,在非必需氨基酸的合成和蛋白质分解代谢中起重要的中介作用。临床上ALT是反应肝脏功能的有效指标。血清中ALT的活性可有意义地评估由感染、药物、酒精及脂肪变性等原因而引起的肝脏损害,对肝脏疾病的诊断,鉴别诊断及病情和疗效的监测方面发挥着重要作用。目前,ALT在临床上的检测方法是利用血清中的丙氨酸氨基转移酶,在一定条件下催化底物L-丙氨酸与α-酮戊二酸生成L-谷氨酸和L-丙酮酸,再针对该反应产物偶联一个指示反应,计算出ALT酶活性浓度。此类方法检测的均是ALT酶活性浓度而不是血清中ALT的质量浓度。酶活性测定方法影响因素多,易受底物浓度、酶蛋白抑制剂、离子强度、pH、温度等多种因素的影响,同时不能有效区分不同的同功酶,因此有必要建立特异的免疫学方法来监测血清中丙氨酸氨基转移酶中实际质量,从而更加真实客观地反应肝脏功能的损害程度。目的:构建人Ⅰ型丙氨酸氨基转移酶(ALT1)的原核表达载体,用纯化的ALT1重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗ALT1多克隆抗体,同时用纯化的ALT1重组蛋白免疫Balb/c小鼠,制备特异性针对ALT1的单克隆抗体,为进一步建立ALT1的免疫学诊断方法和研究ALT1的生物学作用和机制奠定基础。方法:1.采用RT-PCR法扩增ALT1基因片段,并将其分别克隆到原核表达载体pET32a(+)和pGEX-4T-2,构建人Ⅰ型丙氨酸氨基转移酶(ALT1)的原核表达载体。2.将构建的重组表达质粒转化表达宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,对表达蛋白进行SDS-PAGE电泳分析和Western Blot检测,采用亲和层析纯化融合蛋白。3.用纯化的ALT1重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗ALT1的多克隆抗体。4.用纯化的ALT1重组蛋白免疫Balb/c小鼠,制备特异性针对ALT1的单克隆抗体。结果:1.用RT-PCR方法扩增出与预期大小一致的目的基因片段,目的基因与载体连接后的重组质粒经双酶切鉴定及测序分析证实重组质粒构建成功。2.经重组表达纯化,获得了ALT1融合蛋白,其在pET32a(+)/ALT1表达载体中表达形式为不溶性包涵体,在pGEX-4T-2/ALT1载体中有少部份以可溶性形式表达,融合蛋白均能通过亲和层析的方法纯化。3.用纯化的ALT1重组蛋白免疫新西兰大白兔,可制备出特异性针对ALT1的多克隆抗体。4.用纯化的ALT1可溶性重组蛋白免疫Balb/c小鼠,建立了稳定分泌抗ALT1的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为8A9。其抗体亚类为IgG2;将8A9细胞株接种到预处理的Balb/c小鼠腹腔中制备腹水型ALT1单克隆抗体,酶联免疫吸附试验(ELISA)证明腹水效价可达105; Western Blot结果鉴定提示该单克隆抗体可以特异性结合ALT1。结论:经基因重组技术获得ALT1融合蛋白,并对其进行了纯化,制备了特异性针对ALT1的多克隆和单克隆抗体。为我们进一步探讨ALT1的生物学功能及其开发特异性针对ALT1免疫学方法奠定了坚实的基础。