弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)是成人非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkins Lymphoma,NHL)中最常见的一种亚型，约占全部非霍奇金淋巴瘤的30％～40％。采用现代治疗方法，DLBCL初治的完全缓解率可达70-80％，但5年生存率仅40％左右，其中Ⅰ、Ⅱ期患者生存明显优于Ⅲ、Ⅳ期患者，许多缓解患者最终复发死亡。因此早期诊断、疗效判断和随访监测十分重要。目前，DLBCL诊断的金标准为基于肿瘤组织的病理学诊断，并且从基础的形态学、免疫组织化学发展到了分子遗传学水平，如基因表达谱微阵列技术(基因芯片)的广泛应用，其揭示了DLBCL发生、发展过程中部分特征性基因表达变化和功能改变，为寻找新的治疗靶点、预测药物疗效及预后并指导临床治疗提供依据。但在淋巴瘤疗效判断和随访监测中，缺乏特异并敏感的辅助检查手段，我们能否找到较易取材、方便保存的其他组织或细胞，如外周血细胞，来替代肿瘤组织进行上述的相关研究呢?近年来，已陆续有学者报道关于多种疾病外周血细胞基因表达谱分析的多项研究。其研究结果提示外周血细胞基因表达受机体内环境(病理生理改变)或外环境(物理化学刺激)影响，呈动态变化；外周血细胞(主要为白细胞)存在独特的基因表达谱型，能反映这一变化；通过对其基因谱分析，可发现存在某些特征性基因改变，以此鉴别患病人群与健康人群。外周血取材方法侵入性小，操作较为便利，更易为患者所接受，有可能代替传统的肿瘤组织分析进行疾病的相关研究，具有极大的潜力。　　 研究目的：本研究的目的在于运用微阵列技术分析DLBCL与正常人外周血白细胞基因的差异表达，筛选特征基因，建立特征分类预测模型，以期作为一种辅助诊断、疗效评价以及预测预后的检查手段，为将来的新的治疗靶点选择、肿瘤发生发展机制研究提供基础。　　 研究材料和方法：　　 1.研究收集了我院2008年12月至2009年9月初诊的68例DLBCL患者的血液样本及临床资料；其中男性35例，女性33例，中位年龄52岁(8岁～78岁)；按AnnAbor分期，Ⅰ期8例，Ⅱ期30例，Ⅲ期9例，Ⅳ期21例；1个以上结外病变48例，结内病变20例；根据Hans分类原则的亚型分类：GCB组32例(47.1％)，non-GCB组36例(52.9％)。抽取同时期门诊证实的59例健康志愿者血液样本作对照。抽提其总RNA并保存作为研究样本。　　 2.选取28例RNA样本于上海生物芯片有限公司行Agilent全人类基因表达谱芯片分析，包括8例DLBCL患者与20例健康志愿者；运用Genespring10.0软件初步分析芯片的差异表达基因，并通过DAVID在线软件简要分析其相应功能，主要包括基因本体论和信号通道两方面。　　 3.运用微阵列显著性分析(SAM)、F-Score和支持向量机(SVM)相结合的多步骤降维分类法，挑选其中显著差异的特征基因。　　 4.运用实时荧光定量PCR方法验证上述特征基因，利用85例样本建立肿瘤分类预测模型，包括45例DLBCL患者与40例健康志愿者；再利用30例样本作为独立验证组，评判该预测模型的判别能力，包括12个DLBCL患者和18个健康志愿者。　　 结果：　　 1.28例芯片初步分析结果(包括8例DLBCL和20例正常对照)(1)两组男女比例均1∶1，中位年龄，DLBCL组为34.5岁，正常对照组为36.5岁；我们在41000个基因中共发现13815个差异表达基因，其中DLBCL组较正常对照组上调表达基因7074个，下调表达基因6741个。其中，差异倍数(Fc)1.5倍以上者包含7310个(上调3675个，下调3635个)，Fc在2.0倍以上者包含2430个(上调1300个，下调1130个)。　　 (2)Fc2.0倍以上的差异基因本体论分析显示，其主要与免疫应答、造血及淋巴组织器官发育、白细胞活化和Wnt受体信号转导通路等生物学过程有关。分子功能方面主要与DNA结合，核肽结合以及嘌呤核苷酸结合等密切相关。信号通路分析显示主要与细胞周期信号通路、凋亡信号通路、肿瘤相关信号通路、P53信号通路、雌激素受体阴性的乳腺癌MTA-3下调通路、基底细胞癌信号通路和脂肪细胞因子信号通路等9条通路相关。　　 2.生物信息学分析方法筛选特征基因我们通过四种方案筛选出平均分类精确度为100％的4个特征基因数据集，各方案特征基因部分重复，共14个特征基因。聚类分析显示该部分基因均能将DLBCL组和正常对照组正确聚类。　　 3.QRT-PCR验证部分特征异基因(1)结果成功验证了7个基因，它们是BC004503，VISA，GNL3L，KIAA0090，PEX10，PMEPA1，AMBRA1。除GNL3L基因表达水平与芯片结果相反之外，其余6个基因表达水平同芯片结果一致(2)通过F-score+SVM我们建立一个4个基因(VISA,PEX10，PMEPA1，AMBRA1)组成的分类模型，通过独立验证组，证明其敏感性达83.3％，特异性可达为83.3％，ROC曲线下面积达90.1％。　　 结论：　　 1.本研究显示弥漫大B细胞淋巴瘤患者和正常人外周血基因表达谱存在大量差异表达的基因。　　 2.通过基因本体论和信号通路的分析，发现弥漫大B细胞淋巴瘤患者的外周血白细胞存在多条信号转导通路的异常，且与已知DLBCL异常分子标志(基于肿瘤组织的相关研究)不一致。　　 3.本研究显示通过微阵列显著性差异分析(SAM)、F-Score和支持向量机等多步骤降维方法可从海量的芯片数据中筛选出少部分显著判别的基因。　　 4.本研究通过F-Score和SVM的方法建立一个由4个基因(VISA，PEX10，PMEPA1，AMBRA1)的分类预测模型，具有良好的阳性及阴性预测值。