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研究背景与目的宫颈癌(Cervical Cancer,CC)是一种威胁妇女生命健康的常见恶性肿瘤,其发病机率、致死机率在女性最常见的三大恶性肿瘤中排在第二位。宫颈癌病变的发展,由低级别鱗状上皮内瘤变(Cervical Intraepithelial Neoplasia,CIN1)到浸润癌(invasive carcinoma,ICC)的过程大约需要十年,流行病学和分子生物学研究表明宫颈癌的发生发展与高危人乳头瘤病毒(High risk human papillomavirus,hrHPV)持续感染密切相关。降低宫颈癌患者的发病机率和死亡率,使患者得到及时有效的诊治是目前研究的热点,因此采取更为高效的宫颈癌早期筛查措施意义重大。目前,宫颈上皮内病变主要采用液基细胞学(Thinprep cytologic test,TCT)联合检测HPV DNA。传统的HPV DNA的检测有一定的优势,能够区分高危型和低危型HPV,但是其检测存在一定的局限性。其局限性主要有以下:1.传统HPV DNA检测不能区分活性、持续性及进行性感染。2.HPV DNA在凋亡的细胞和细胞碎屑也可表达,从而出现一定的假阳性。HPV基因组学研究显示,HPV编码包括6个早期开放读码框(E1,E2,E4,E5,E6和E7)及2个晚期读码框(L1和L2)。HPV E6/E7是病毒癌基因,其表达显著介导抑癌基因p53和视网膜母细胞瘤样蛋白(Retinoblastoma protein,Rbp)的降解,从而干扰细胞周期调节,导致宿主细胞恶性转化。HPV E6/E7 mRNA在宫颈组织中表现癌基因活性。以往文献研究表明,HPV E6/E7 mRNA水平与宫颈上皮内病变严重程度相关。Seterdal等及Molden等研究发现,与HPV DNA相比,HPV mRNA具有高特异性及阳性预测值。国外研究发现,在宫颈上皮细胞内瘤变的过程中大多数存在3号染色体长臂人端粒酶mRNA(human telomerase mRNA component,hTERC)基因的异常扩增,该基因的异常表达是宫颈肿瘤发生的基础,同时可能也是宫颈癌形成的早期事件。因此hTERC基因检查,不仅可以判断病变的情况,更可以对其发展进行评估。国内外对HPV E6/E7 mRNA和hTERC在宫颈上皮内病变中的研究只停留在单一指标的研究,二者在宫颈病变中的联合研究尚未见文献报道。综上所述,本研究采用分支链DNA技术(branch DNA,b-DNA)及荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)分别检测HPV E6/E7 mRNA和hTERC在不同病变程度的宫颈组织学和细胞学的表达情况,并且分析HPV E6/E7 mRNA与hTERC基因联合检测的特异性、敏感性、阳性预测值和阴性预测值。通过本研究初步探讨HPV E6/E7 mRNA和hTERC在宫颈癌诊断及评估宫颈病变风险进展的临床价值,以期为临床宫颈癌早期筛查提供一定依据。材料与方法1.收集黄河中心医院2016年7月至2017年10月的135例宫颈液基细胞学标本。按宫颈细胞学Bethesda系统(the Bethesdasystem,TBS)分组,样本含量如下:NILM组27例、ASCUS组36例、LSIL组16例、ASC-H组13例、AGC组7例、HSIL组30例和SCC组6例;按照病理组织学诊断分组,样本含量如下:正常/炎症组27例、CIN1组35例、CIN2组33例、CIN3组28例和ICC组12例。本研究中,所有患者最终检测结果以病理组织学诊断作为金标准。2.采用b-DNA技术检测宫颈液基细胞学标本中HPV E6/E7 mRNA水平,采用FISH技术检测宫颈液基细胞学标本中hTERC基因扩增情况。3.比较不同级别组织学及不同级别细胞学标本中HPV E6/E7 mRNA表达状况和观察hTERC基因扩增的情况。4.采用SPSS 19.0软件进行数据统计,分析单一指标及二者联合的特异性、敏感性、阳性预测值和阴性预测值。不同组别之间采用X~2检验,以P<0.05提示为差别具有统计学意义。结果1.HPV E6/E7 mRNA在不同级别组织学分类中的表达情况:在135例标本中,HPV E6/E7 mRNA的阳性检出率为65.19%(88/135)。HPV E6/E7 mRNA在正常/炎症组,CIN1组,CIN2组,CIN3组和ICC组中阳性表达率依次升高,分别为33.3%(9/27),45.7%(16/35),78.8%(26/33),89.3%(25/28)和100%(12/12)。HPV E6/E7 mRNA表达水平在宫颈不同组织学诊断级别中差异有统计学意义(χ2=34.18,P<0.01)。2.HPV E6/E7 mRNA在不同级别细胞学分类中的表达情况:在135例标本中,HPV E6/E7 m RNA在NILM组,ASCUS组,LSIL组,ASC-H组,AGC组,HSIL组和SCC组中阳性表达率基本成升高态势,分别为33.3%(9/27),52.8%(19/36),56.3%(9/16),84.6%(11/13),100%(7/7),90%(27/30),100%(6/6)。HPV E6/E7 mRNA表达水平在宫颈不同细胞学诊断级别间差异有统计学意义(χ2=32.32,P<0.01)。3.hTERC基因在不同级别组织学分类中的扩增情况:在135例标本中,hTERC基因的扩增阳性率为49.63%(67/135)。hTERC基因在正常/炎症组,CIN1组,CIN2组,CIN3组和ICC组中hTERC基因扩增的阳性率依次升高,分别为7.4%(2/27),14.29%(5/35),63.6%(21/33),96.4%(27/28)和100%(12/12)。hTERC基因扩增水平在宫颈不同组织学诊断级别间的差异有统计学意义(χ2=76.04,P<0.01)。4.hTERC基因在不同级别细胞学分类中的扩增情况:在135例标本中,hTERC基因在NILM组,ASCUS组,LSIL组,ASC-H组,AGC组,HSIL组和SCC组中扩增阳性率依次升高,分别为7.4%(2/27),19.4%(7/36),56.3%(9/16),61.5%(8/13),85.7%(6/7),96.7%(29/30),100%(6/6)。hTERC基因扩增水平在宫颈不同细胞学诊断级别间差异有统计学意义(χ2=69.68,P<0.01)。5.HPV E6/E7 mRNA、hTERC基因检测和两种方法联合检测结果比较:联合检测的特异性、敏感性、阳性预测值均高于单纯HPV E6/E7 mRNA及hTERC基因检测,通过对三种检测方法之间的特异性、敏感性、阳性预测值比较其差异均具有统计学意义(χ2分别为11.15、8.81、8.66,P<0.05)。结论1.联合检测HPV E6/E7 mRNA和hTERC基因的敏感性、特异性及阳性预测率均高于两种方法的单独检测。2.HPV E6/E7 mRNA和hTERC基因的表达能够反映宫颈病变的发展过程,二者联合检测有助于提高宫颈癌的早期筛查率。