论文部分内容阅读
近年来,高密度水产养殖业的快速发展带来了水环境污染的日益加剧,致使各种水产病害特别是病毒性疾病大规模爆发,给鱼类养殖造成了巨大的经济损失。新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)就是一种从养殖的石斑鱼中分离到的水产动物重要病毒病原。鱼类细胞培养是进行鱼类病毒分离繁殖,进而研究鱼类病毒的致病机理、病毒宿主相互作用以及研制疫苗的最基础一步。而疫苗作为化学药品和抗生素的替代品,是治疗疾病、特别是病毒病的最好选择。本研究建立了赤点石斑鱼肝组织细胞系,同时根据SGIV全基因组序列信息,运用反向疫苗学分析方法,从大量的病毒编码基因中鉴定到了3个能产生明显保护作用的基因,同时对SGIV囊膜蛋白VP16的分子特征进行了分析。结果简述如下:
1)赤点石斑鱼肝组织细胞系的建立与特征分析。细胞在温度25-30℃、含10%胎牛血清的MEM培养基中增殖良好。在25℃培养条件下,细胞生长速率随着血清浓度(5-20%)的升高而增加,最佳血清浓度为15-20%。染色体分析显示特征染色体数目为48条。本研究进一步分析了细胞对4种鱼类病毒的敏感性,结果显示仅有SGIV感染的细胞观察到了明显的细胞病变效应,免疫荧光和电镜观察进一步确认了细胞的SGIV敏感性。细胞转染pEGFP-N3质粒后观察到了明显的绿色荧光,说明此细胞系能够用于转基因和基因遗传操作。
2)SGIV DNA疫苗候选基因的鉴定。运用反向疫苗学的分析方法,利用一系列生物信息学工具从SGIV全基因组序列中筛选到了13个疫苗候选基因,克隆到真核表达载体pcDNA3.1,免疫石斑鱼幼鱼,鉴定到了3个能产生明显保护作用的基因。
3)SGIV VP16的克隆及分子特征分析。从SGIV全基因组中克隆了VP16编码基因全长,原核表达纯化并免疫小鼠制备了抗体。序列分析表明,VP16编码基因是蛙病毒属特有的基因。RT-PCR、Western-blot分析与药物抑制实验揭示该基因是一个晚期基因。免疫荧光观察结果表明,VP16在感染细胞中主要聚集在病毒加工厂。同时本研究比较了三种不同的表面活性剂(Triton X-100、NP-40和SDS)分离SGIV囊膜蛋白的效果。结果表明,0.1%SDS能完全溶解病毒囊膜而不破坏衣壳的完整性,达到分离囊膜的效果。利用上述方法,证明了VP16是病毒的外囊膜蛋白。