研究背景与目的神经母细胞瘤(Neuroblastoma NB)是儿童中一种最常见的恶性实体性肿瘤疾病,其发病率在儿童肿瘤中约占10%左右,此病的危害性仅次于白血病和中枢神经系统肿瘤,预后效果较差。神经母细胞瘤为一种神经内分泌肿瘤,它起源于交感神经系统中的神经嵴祖细胞,好发生于肾上腺、颈部、胸部、腹部等神经组织。大量临床研究证实,神经母细胞瘤具有恶性程度高、异质性高、易发生转移和复发、预后差等多种临床特点。目前,医学针对神经母细胞瘤的临床治疗方案有限、效果不佳,除少数患者可自行缓解或进行肿瘤早期完全切除以外,大多数患者还存在预后较差,五年生存率低于40%的问题。分子生物学试验显示,体内多种基因的异常表达与儿童神经母细胞瘤的分级、治疗和预后具有密切联系,如MYCN异常表达、抑癌基因序列lp36.1及lp36.2缺失等。目前,人们对于神经母细胞瘤发生发展的详细分子机制尚不明确。因此,研究神经母细胞瘤发病的分子机制,筛选调控肿瘤细胞增殖与分化的关键靶点,阐明其调控神经母细胞瘤细胞增殖与分化的作用机理,可以为神经母细胞瘤的临床诊断和治疗提供新策略及新型方法,具有较大临床意义。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度在18-22 nt的非编码小RNA分子,能够与特定mRNA的3-UTR区互补结合,从而抑制mRNA的翻译,调控基因蛋白水平的表达。研究表明,miRNA分子广泛参与着细胞内的各种生理病理过程,且与肿瘤的发生发展关系密切。例如,miR-23a能够同时抑制st71表达且促进IKKα的表达,这种调控下进一步促进卵巢癌的发生及发展进程;Zhao L等研究发现,miR-490可以抑制乳腺癌细胞的增殖和转移,且研究证明miR-490具有抑癌基因的功能。YuB等研究表明,miR-148a通过STAT和AKT信号通路靶向调控CCK-BR的表达,从而抑制乳腺癌的发生发展。大量证据显示,miRNA在神经母细胞瘤中也存在表达异常现象,多种miRNA分子参与调控了神经母细胞瘤的增殖、侵袭、转移、凋亡等过程,这表明miRNA在神经母细胞瘤中发挥着重要作用。miR-25是近年来发现的肿瘤相关miRNA分子之一,属于miR-106b-25家族,位于人第7号染色体,在多种肿瘤中表达上调,在肿瘤的发展过程中起着重要的调控作用。Petrocca等研究发现miR-106b-25簇(miR-106b、miR-25、miR-93)在胃癌细胞中高表达,其表达受E2F1调节因子的调控,同时,miR-106b和miR-93又能调节E2F1的表达,因此形成了一个负反馈调节通路。在非小细胞肺癌中,miR-25表达上调,且通过靶向FBXW7基因促进肿瘤的增殖和侵袭转移,具有癌基因的功能;miR-25参与调节多个靶基因,但其在神经母细胞瘤中的功能及调控机制仍有待进一步研究。因此,在上述研究基础上,本文旨在探讨并明确miR-25在神经母细胞瘤发生发展中的作用机理。本文将分为三个部分进行研究,首先通过qRT-PCR方法从基因水平上验证miR-25在神经母细胞瘤组织标本及细胞中的表达情况,其次进一步从细胞水平验证miR-25对神经母细胞瘤的增殖、凋亡、侵袭、转移的影响,最后通过计算机软件预测及分子生物学试验探索miR-25在神经母细胞瘤发挥作用的机制。总之,本试验为深入了解miRNA在神经母细胞瘤中的功能及分子机制奠定了理论依据及技术支持。本论文的主要试验框架及研究内容如下图所示:研究方法1.第一部分:miR-25在神经母细胞瘤组织标本及细胞中的表达及临床意义:首先收集34例患有小儿神经母细胞瘤病的肿瘤组织,同时对收集的组织标本进行相关信息的记录,采集的病料标本首先在液氮环境中进行迅速冰冻,随后立即将标本储存于-70 ℃冰箱中备用。迅速复苏购买的神经母细胞瘤细胞株,并用10%的胎牛血清对复苏后的细胞进行培养。细胞培养后再分别利用RNA提取试剂盒进行组织及细胞总RNA的提取,并反转录RNA合成cDNA备用,最后试验采用qRT-PCR方法检测miR-25在神经母细胞瘤组织及细胞中的基因表达水平。2.第二部分:miR-25对神经母细胞瘤细胞增殖、侵袭及迁移的影响:首先人工合成miR-25 mimics及miR-25 inhibitors,用绿色荧光蛋白进行标记;其次利用LipolifectmianrM2000将上述合成的样品转染至神经母细胞瘤SH-SY5Y和IMR32细胞株中,随后进行细胞转染率的检测;本试验利用CCK-8试验检测miR-25 mimics 及 miR-25 inhibitors 对细胞株 SH-SY5Y 和 IMR32 增值能力的影响;流式细胞术试验检测miR-25 mimics及miR-25 inhibitors对神经母细胞瘤细胞周期活性的影响;Transwell试验检测miR-25 mimics及miR-25 inhibitors对细胞株SH-SY5Y和IMR32侵袭及迁移能力的影响。本试验主要的目的是明确miR-25 mimics及miR-25 inhibitors对神经母细胞瘤细胞增殖、迁移及侵袭等生物学行为的影响。3.第三部分:miR-25靶基因TOB1的筛选及鉴定:首先利用生物信息学软件对miR-25相关靶基因进行筛选;随后人工构建筛选的靶基因的野生型和突变性荧光素酶报告质粒,将构建的质粒及对照空质粒共转染至HEK293T细胞中,鉴定荧光素酶活性并进行miR-25靶基因的初步判断;最后细胞转染miR-25 mimics 及 miR-25 inhibitors,分别在基因及蛋白水 平上检测预测靶基因mRNA及蛋白表达变化水平,以达到通过双向分析方法验证miR-25对靶基因的调节作用。研究结果1.相比较于低危组神经母细胞瘤组织,高危组标本中miR-25的表达量显著增加,且miR-25的表达量与肿瘤分期呈正相关性,即分期越高miR-25的表达量越多(P<0.05)。相比较于原发瘤细胞,转移瘤细胞中miR-25的表达量明显增高(P<0.05)。2.利用荧光显微镜对miR-25 mimics和miR-25 inhibitors转染至细胞株SH-SY5Y和IMR32的成功效率进行检测。CCK-8试验检测细胞增值率结果发现,miR-25的高表达显著促进了神经母细胞瘤细胞的增值能力,其中与阴性对照组相比,在miR-25 mimics转染细胞株IMR32之后的48-72 h内细胞OD值显著升高(P<0.05),而下调miR-25的表达可抑制细胞株SH-SY5Y的细胞增殖能力。Transwell试验检测miR-25对神经母细胞瘤细胞侵袭及迁移能力,研究结果显示,miR-25可以显著增强神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y和IMR32的迁移及侵袭能力。与对照组相比较,上调miR-25的表达之后我们发现神经母细胞瘤细胞迁移至下孔的数量增加,这表明神经母细胞瘤细胞的迁移及侵袭能力显著提高(P<0.05),此外,下调miR-25的表达后显示神经母细胞瘤细胞的迁移及侵袭能力明显受到抑制(P<0.05)。流式细胞术试验分析肿瘤细胞在不同分期的细胞数量结果显示,与对照组相比较,上调miR-25的表达可以使细胞株IMR32在S期的细胞数明显增加,而在G1期时细胞数量显著减少(P<0.05),下调miR-25的表达后,可以使细胞株SH-SY5Y在G1期时细胞数量增多,而在S期的细胞数目显著减少,这表明肿瘤细胞的增值能力受到影响且凋亡数量增加(P<0.05)。因此我们猜想miR-25起作用的时期可能是在细胞尚未进行有丝分裂到即将要开始进行有丝分裂的过程中。3.利用靶基因预测软件我们初步筛选出TOB1为miR-25的的潜在靶基因。双荧光素酶试验结果进一步证实miR-25可以与TOB1的3‘UTR结合,在进行共转染后发现TOB1的表达量降低。为了在基因水平上进一步证实miR-25对TOB1 mRNA的影响,qRT-PCR试验显示上调miR-25可以显著降低TOB1 mRNA的表达量(P<0.05)。Western blot结果显示上调miR-25的表达后神经母细胞瘤细胞中TOB1的表达量受到抑制(P<0.05),而在低表达miR-25后神经母细胞瘤细胞中TOB1的表达量增加(P<0.05)。研究结论1.恶性神经母细胞瘤组织标本及细胞中miR-25的表达量显著高于低危性神经母细胞瘤组织及细胞,因此miR-25可以作为神经母细胞瘤高低危性诊断及预后判断的一个重要性指标。2.上调miR-25的表达可以使神经母细胞瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力显著增强,而抑制miR-25的表达可以呈现相反的结果。此外,miR-25在神经母细胞瘤细胞G1-S期起到明显的干扰作用。因此miR-25在神经母细胞瘤中发挥癌基因的作用。3.miR-25可以与TOB1的3’UTR靶向结合,且可以控制TOB1基因的转录后翻译,为神经母细胞瘤的治疗提供新的靶点。