背景肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是世界范围内常见的恶性肿瘤,在我国尤为多发。我国每年因肝癌死亡人数约10万人,占全世界肝癌死亡人数的45%。复发与转移是包括肝癌在内的恶性肿瘤发生发展进程中的关键和致死性步骤,关于肿瘤复发与转移机制的研究历史已经超过100年,随着科学家们对于原发肿瘤生长、浸润以及组织微环境等因素研究的逐步深入,肿瘤的诊断与治疗方法也随之取得了很大进展,但目前临床上现有的治疗方法依然不能克服肿瘤复发与转移的难题,肿瘤患者的生存率并未得到显著改善。近年来研究表明,肿瘤细胞具有异质性,也就是说并不是所有的肿瘤细胞都具有形成新肿瘤的能力,只有其中的小部分细胞才具有成瘤性,这一小群细胞具有与正常干细胞类似的特性,如自我更新、无限增殖和多向分化的能力,而且还具有一定的化疗药物抵抗性,于是将这群细胞称为肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSC,或称肿瘤始动细胞tumor-initiating cells, TICs)。科学家们认为肿瘤干细胞的来源可能包括以下两种:其一是正常干细胞发生某种突变而转化为肿瘤干细胞;其二是已分化细胞在某种机制的下发生去分化而转变为肿瘤干细胞。目前临床上对肿瘤的治疗手段并不特异地针对肿瘤干细胞,可能正是由于肿瘤干细胞的存在,才是导致肿瘤发生、发展、转移乃至复发的根本原因。如果能够在体外分离获得肿瘤干细胞,并在此基础上探讨其发生、维持及发挥作用的调控机制,乃至进一步获得关键性调控分子并阐明其作用机理,这不仅在理论方面有助于揭示肿瘤发生的本质,更可以在临床实践中为肿瘤的预防和治疗提供有效靶标。目前对肿瘤干细胞的分离主要是利用细胞表面特异性标记分子,如白血病中的CD34+CD38-细胞、乳腺癌中CD44+CD24-细胞以及结肠癌中的CD133+细胞等等,关于肝癌肿瘤干细胞的研究主要是利用CD44,CD90,EPCAM,CD133等表面标记分子。近年来的研究表明,在正常干细胞发生及维持过程中发挥重要作用的表观遗传学调控机制同样可能在肿瘤干细胞的发生与维持中扮演重要角色。表观遗传学调控是指在基因组DNA序列不发生改变的前提下,生物体发生的可遗传的变异,而这种改变没有直接涉及基因序列信息。表观遗传学调控包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体重塑和非编码RNA调控等。近年来,越来越多的研究表明,非编码RNA调控中的microRNA调控多与肿瘤的发生发展相关。microRNAs(miRNAs)是一种约21~25个碱基组成的内源性非编码RNA分子,可以通过部分或完全互补的方式结合到目的mRNA的3’非编码区(3’UTRs),以诱导翻译抑制或使mRNA降解的方式,从而抑制蛋白质合成。随着对microRNAs研究的不断深入,科学家们发现microRNAs参与生命过程中一系列的重要进程,其中包括早期发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞死亡、脂肪代谢和细胞分化等等。Erwei Song等人的研究表明,在乳腺癌肿瘤细胞中过表达microRNA let-7可以降低BT-IC即乳腺癌肿瘤干细胞的体外增殖能力、集落形成能力和未分化细胞的比例,在裸鼠体内可以降低成瘤性和体内转移能力[1]。但是,对于肝癌肿瘤干细胞的发生、维持及发挥作用的调控机制尤其是表观遗传学的调控机制,目前尚少有报道。目的本研究旨在利用细胞表面标记分子CD90来分离肝癌肿瘤干细胞,并对其生物学性状进行鉴定,在证明CD90+细胞具有肿瘤干细胞的特性之后,利用microRNA芯片对肝癌肿瘤干细胞,即CD90+细胞和非肝癌肿瘤干细胞CD90-细胞进行microRNA表达的差异性分析,从中筛选出差异表达明显的microRNAs,并构建其表达载体,观察其对肝癌细胞的影响,以期获得一个或多个可能对肝癌发生发展具有促进或抑制作用的microRNA,并探索其发生可能发挥作用的分子机制,从而为临床上指导肝癌的诊断和治疗奠定基础。方法1.肝癌肿瘤干细胞的分离与鉴定首先利用流式细胞术对几种肝癌细胞系进行了CD90+细胞含量的检测,然后利用免疫荧光和流式细胞术的方法在肝癌组织中检测CD90+细胞是否存在。进一步利用免疫磁珠分选的方法从肝癌细胞系中分离出了CD90+细胞,采用化疗药物抵抗性实验、裸鼠皮下成瘤性实验等从多个方面对CD90+细胞和CD90-细胞的生物学特性进行分析鉴定。2.肝癌肿瘤干细胞中特异性表达的microRNAs的筛选利用microRNA芯片筛选肝癌细胞中CD90+细胞和CD90-细胞中差异性表达的microRNA,并利用实时定量PCR技术以及TaqMan qRT-PCR实验对microRNA芯片结果进行了部分验证。3.对筛选出来的microRNA的生物学作用进行探究通过对芯片结果的分析和验证,从中初步筛选出了差异性表达比较显著的microRNA-146a。为了研究其作用机制,利用pHRS-EGFP载体构建了过表达载体,然后将pHRS-1cla-miR-146a-CMV-EGFP重组质粒稳定转染入肝癌细胞系MHCC97H中,建立了稳定过表达microRNA-146a的肝癌细胞系,从体外增殖能力和裸鼠皮下成瘤能力等角度对其作用进行了初步的观察。结论1.流式细胞术检测到几种肝癌细胞系中均含有CD90+细胞,其含量如下:MHCC97H中CD90+细胞含量为8.23%、MHCC97L中CD90+细胞含量为2.23%、PLC中CD90+细胞含量为5.5%、HepG2中CD90+细胞含量为0.23%、SNU-182中CD90+细胞含量为0.9%、SNU-449中CD90+细胞含量为0.29%、SMMC-7721中CD90+细胞含量为0.53%、HBXF-344中CD90+细胞含量为0.28%;肝癌组织标本的免疫荧光切片中检测到了CD90+细胞的存在;流式细胞术在三例肝癌组织标本中检测CD90+细胞的含量分别是1.2%、11.07%、29.59%;利用免疫磁珠分选方法从肝癌细胞系MHCC97H中分离出了CD90+细胞,流式细胞术检测分选后CD90+细胞的纯度为71.53%,达到了富集CD90+细胞的目的,可以进行下一步实验;化疗药物抵抗性实验的结果表明,无论是奥沙利铂、顺铂、5-FU还是奥沙利铂和5-FU联合用药,在几个浓度梯度之下,与CD90-细胞相比,CD90+细胞表现出明显的化疗药物抵抗能力;两次裸鼠皮下成瘤性实验结果分别是,第一次实验CD90+细胞六只裸鼠五只成瘤,第二次实验利用从第一次实验CD90+细胞形成的瘤体中分离出的肿瘤细胞体外培养扩增,然后从中分选出CD90+细胞进行成瘤性实验,结果为五只裸鼠四只成瘤,而两次实验CD90-细胞无一只裸鼠形成肿瘤。此结果可以确切的表明,CD90+细胞具有非常强大的体内成瘤能力,而CD90-细胞不具有任何的成瘤能力。以上一系列实验可以得出结论,即CD90+细胞具有肝癌肿瘤干细胞的特性。2.利用microRNA芯片比较CD90+细胞与CD90-细胞microRNA的表达差异。芯片结果表明,CD90+细胞与CD90-细胞之间共有92个microRNAs的表达存在差异性,其中在CD90+细胞中高表达的microRNAs有52个;在CD90-细胞中高表达的microRNAs有40个。所列信号值采用p值< 0.01的重复探针信号值的中间值,差异倍数以对数(log2)显示,差异倍数大于1者可视为有显著性差异。以此为据,从92个表达差异的microRNAs中筛选出差异表达显著的31个microRNAs,其中在CD90+细胞中高表达的microRNAs有21个;在CD90-细胞中高表达的microRNAs有10个。利用实时定量PCR技术检测这31个microRNAs在MHCC97H、MHCC97L和PLC三种肝癌细胞系中的CD90+细胞与CD90-细胞之间的表达情况,并进一步从结果中筛选出差异表达比较显著而且稳定的7个microRNAs,即microRNA-146a、microRNA-19b、microRNA-7、microRNA-17、microRNA-106a、microRNA-513-5p和microRNA-20b,然后利用TaqMan qRT-PCR技术对该7个microRNAs进行验证。3.通过以上一系列的验证,最后筛选出一个差异性表达显著而且差异表达趋势稳定的目的microRNA,即microRNA-146a。首先构建了microRNA-146a的表达载体,并通过慢病毒转染的方式建立了稳定表达microRNA-146a的肝癌细胞系,实时定量PCR检测到稳定表达microRNA-146a的肝癌细胞系可以过表达microRNA-146a约9倍。cck-8实验结果表明过表达microRNA-146a的肝癌细胞系MHCC97H的增殖能力明显高于对照组细胞;划痕实验结果表明过表达microRNA-146a后的肝癌细胞系MHCC97H的迁移能力显著性提高;裸鼠皮下成瘤性实验结果表明过表达microRNA-146a后的肝癌细胞系MHCC097H的裸鼠皮下成瘤能力显著性提高。