拟南芥锌指蛋白基因AtSRZ5的功能研究和盐胁迫下水稻叶片蛋白质组学分析

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mRNA的转录后调控是基因表达调控的一个重要途径。RBP蛋白(RNA-binding proteins, RNA结合蛋白)一直被认为是mRNA稳定性和翻译的主要调控因子。近年来的研究表明,miRNA (microRNA,微小RNA)也能够影响mRNA的稳定性和翻译。RBP蛋白和miRNA可以通过协同作用影响mRNA的去稳定性和翻译抑制作用,也可以互相竞争对靶mRNA产生相反的效应。目前动物中的一些关键研究为两者间的互作机制提供了关键证据,但植物中还鲜有相关报道。本研究表明,拟南芥(Arabidopsis thaliala)中C2C2(DWXCX1-4CX3NX6CX2C)型锌指蛋白SRZ5 (Stress Repressive Zinc Finger Protein 5,胁迫抑制锌指蛋白5)是一种胁迫相关蛋白,含有3个ZnF (RanBP2-type zinc finger)结构域。C2C2型锌指蛋白在植物中广泛存在,在拟南芥和水稻中它分别有5个和4个同源蛋白。在动物中,含有ZnF结构域的蛋白普遍具有RNA结合活性。而RNA结合实验证实,AtSRZ5也具有RNA结合活性,并且可以特异性结合ARE元件(AU-Rich element, AU富集元件)。此外,AtSRZ5能够与RISC (RNA-induced silencing complex, RNA诱导的沉默复合体)众AGO1(Argonaute-1)互作,可能参与了miRNA介导的mRNA降解。AtSRZ5参与了胁迫响应,并且AtSRZ5的缺失突变能够降低拟南芥种子在萌发时对ABA和盐胁迫的敏感性。在ABA诱导后,srz5中ABI3(ABA insensitive 3, ABA不敏感蛋白3)、ABI5 (ABA insensitive 5, ABA不敏感蛋白5)、Eml(Late Embryogenesis Abundant1,胚胎发生晚期丰富蛋白1)和Em6 (Late Embryogenesis Abundant 6,胚胎发生晚期丰富蛋白6)的表达量显著低于野生型对照。此外,对生长素信号途径中相关基因的表达量也经行检测。在srz5中,GH3.3 (Gretchen Hagen 3.3)上调表达,ARF6 (Auxin Response Factor 6,生长紊响应因子6)mRNA的降解被抑制,而ARF10 (Auxin Response Factor 10,生长素响应因子10)mRNA的降解被促进。AtSRZ5能够通过生长素信号途径影响ABA信号途径中AB13的表达。对ARF6、ARF8、ARF10、ARF16和ARF17的mRNA序列上ARE元件进行分析后发现:1、不包含ARE元件的ARF16和ARF17 mRNA的降解在srz5中没有变化;2、3’UTR区域含有ARE元件的ARF8和ARF10 mRNA的降解在srz5中提高;3、非3’UTR区域含有ARE元件的ARF6 mRNA的降解在srz5中减少。推测AtSRZ5与miR160和miR167之间存在协同和竞争作用,并且这是由靶mRNA序列中ARE元件特征决定的。此外,在srz5中,包含AB15第一个内含子的mRNA前体含量也较野生型对照中提高。根据相关报道,在动物中含有ZnF结构域的RBP蛋白具有剪接调控因子的功能。并且在ABI5 mRNA前体第一个内含子区域含有多个ARE元件。因此推测AtSRZ5在拟南芥中也具有剪接调控因子功能。因此,AtSRZ5作为一个RNA结合蛋白,参与了mRNA的转录后调控,对其的研究有助于全面了解C2C2型锌指蛋白在植物中所发挥的功能。同时,AtSRZ5受到ABA和生长素的诱导,关于SRZ5的研究对于揭示植物对非生物胁迫响应的机制和萌发时植物激素之间的联系有着重要意义。此外,本文利用iTRAQ (isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation,同重同位素标记相对和绝对定量)技术分析水稻(Oryza sativa L.)叶片蛋白质组对盐胁迫的响应,共鉴定到1,731个蛋白,在56个盐胁迫下差异表达蛋白中有43个上调表达蛋白和13个下调表达蛋白,并进一步利用qRT-PCR (real-time quantitative reverse transcription PCR,荧光定量PCR)对差异表达蛋白编码基因进行分析。这些蛋白主要参与了光合作用、抗氧化和氧化磷酸化作用。根据iTRAQ数据、差异表达蛋白编码基因的表达特征和已有报道,我们推测:在盐胁迫下,抗氧化物质能够调节PSI(photosystem I,光系统Ⅰ)和PSIⅡphotosystemⅡ,光系统Ⅱ),继而控制ATP (Adenosine Triphosphate,三磷酸腺苷)和NADPH (Nicotinamide adenine dinucleotide 2-phosphate reduced,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)的比例,维持水稻在盐胁迫环境中的碳固定。其中,过氧化物酶Q的上调表达以及硫氧还蛋白M、硫氧还蛋白过氧化物酶和GSTF3的下调表达抑制PsaH(PSI subunitH,光系统Ⅰ亚基H)并促进PsaD (PSI subunit D,光系统Ⅰ亚基D),对循环电子传递和NADPH合成进行调节,提高ATP的合成并降低NADPH的含量,为碳固定维持ATP/NADPH比例,同时减少多余的NADPH合成以降低ROS的生成;同时,过氧化物酶Q能够保护PSII,为碳固定提供ATP。而盐胁迫对碳固定的影响可能进一步影响离子平衡所需能量的供应。在水稻受到盐胁迫后,水稻叶片蛋白质组被重编程,各差异表达蛋白之间相互联系,对盐胁迫进行响应。
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