阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis，Tv)是一种寄生于人阴道及泌尿道的鞭毛虫，引起毛滴虫病，呈世界性分布。感染轻微时，患者无症状；感染严重时，患者出现炎症反应等一系列临床症状。毛滴虫病的临床诊断常规方法是采用涂片法结合显微镜检查，但漏检率高、检出率较低，而公认诊断毛滴虫病的“金标准”一培养法虽然检出率高，但需要时间长，国内临床上较少应用。研究新的诊断方法和开发新的诊断试剂是毛滴虫病临床医学需要解决的重要难题之一。毛滴虫富含多种半胱氨酸蛋白酶(cysteine proteinase，cysteinepeptidase，cysteine protease，CP)，其中一些为分泌性成分。复性电泳显示，具半胱氨酸蛋白酶活性的蛋白酶分子量在23 kDa到110 kDa之间，条带清晰的可达10余条，这对于开发与TvCP相关的诊断和防治等制剂提供了物质条件。但是从虫体蛋白中纯化CP的方法较为复杂，得率低，难以大批量生产，这极大限制了CP在临床上的广泛使用。为此，通过基因克隆技术和生物信息学方法，对阴道毛滴虫半胱氨酸蛋白酶(TvCP)基因序列进行分析，阐述其遗传与变异特点，并在此基础上，应用DNA重组技术，将克隆的TvCP在原核表达系统表达，表达产物纯化后免疫小鼠以制备高免血清，从而为进一步开发半胱氨酸蛋白酶相关免疫诊断制剂奠定基础。 本研究利用PCR扩增TvCP基因，用pBS-T或pET28b载体构建重组质粒并转化到大肠杆菌(Escherichia coli)，筛选阳性克隆，测定核苷酸序列。通过Blast从NCBI数据库(GenBank)、阴道毛滴虫基因组计划数据库(TIGR Trichomonas vaginalis GenomeProject)、欧洲分子生物学实验室(EMBL)数据库和欧洲生物信息研究所(EBI)Merops数据库中检索同源序列，应用ClustalW/X、DNAStar等生物分析软件分析TvCP核苷酸和氨基酸序列多态性、遗传变异和进化规律。用编码TvCP3前体酶和成熟酶的基因片段构建重组表达质粒pET28b-TvCP3和pET28b-TvCP3C，转化E. coli BL21(DE3)后进行诱导表达，经IMAC(immobilized metal affinity chromatography)金属螯合层析法对表达产物重组蛋白进行纯化，纯化产物复性后免疫Balb/c小鼠，用ELISA测定血清抗体滴度。采集高滴度的小鼠血清制备高免血清，利用免疫印迹(Western blot)测定抗体所识别的阴道毛滴虫虫体或分泌物中特异性抗原组分。结果表明，试验所获得的Tvcp2基因1个克隆、TvCP3基因2个克隆分别与数据库中TvCP2和TvCP3参考序列在核苷酸和氨基酸水平上的相似性均达99％以上，高度保守。TvCP4基因3个克隆与GenBank和TIGR T. vaginalis数据库中TvCP4参考序列在核苷酸和氨基酸水平上的相似性在97％以上，呈现一定程度的变异性，但仍属于TvCP4基因家族3个成员中的2个基因；TvCP4酶前体分子由305个氨基酸残基组成，在TIGR数据库中，共有大小一致的TvCP4同源分子9个和N-末端缺少20个氨基酸残基的同源分子1个，它们之间的氨基酸序列相似性在62.3％～96.7％之间。TvCP1-4、TvCP12、TvCP25和CP65之间也有较高的同源性，氨基酸序列相似性约为61％～88.2％。此外，阴道毛滴虫还拥有为数众多的其它L样组织蛋白酶成员，使TvCP呈现多样性。序列联配和聚类分析表明TvCP酶活性位点和形成二硫键的半胱氨酸残基数目和位置非常保守，进化树分析也表明它们可能由共同的祖先分子通过基因复制和不断突变进化而来，且一部分TvCP与人L样组织蛋白酶和木瓜蛋白酶氨基酸序列相似性约为50％，聚类分析处在进化树相邻分支上，在进化上具有一定的亲缘关系。 TvCP3及有关同源蛋白酶活性位点Q(谷氨酰胺)和N(天门冬氨酰胺)之间氨基酸序列聚类分析结果显示，TvCP3和已克隆的其它阴道毛滴虫TvCP1、TvCP2、TvCP4、TvCP12、TvCP25和CP65氨基酸序列(活性位点Q～N之间)的相似性为53.3％～62.2％，TvCP3与小鼠L样组织蛋白酶(组织蛋白酶L、K和S)氨基酸序列的相似性35.3％～40.9％，与人L样组织蛋白酶(组织蛋白酶L、S和K)氨基酸序列的相似性为19.8％～41.5％，与其它原虫如溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、刚第弓形虫(Toxoplasma gondii)、蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia/intestinalisi)、恶性疟原虫(Plasmadium falciparum)、布氏锥虫(Trypanpsoma brucei)、克氏锥虫(T.cruzi)、婴儿利什曼原虫(Leishmania Infantum)等L样组织蛋白酶的相似性为19.8％～33.9％，与寄生性蠕虫如日本裂体吸虫(Schistosomajaponicum)、猪带绦虫(Taenia solium)、马来布鲁线虫(Brugia malayi)等蠕虫L样组织蛋白酶的相似性为19.2％～36.7％。这些分析结果表明，TvCP3抗原应用于毛滴虫病免疫诊断中，已经具备了特异性强的分子基础。 将TvCP3全长基因和编码成熟蛋白酶的基因片段分别克隆于His融合表达载体pET-28b(+)构建成重组表达质粒pET28b-TvCP3和pET28b-TvCP3C，在转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株后经IPTG诱导成功表达了His-TvCP3和His-TvCP3C融合蛋白，分子质量分别约为40.5 kDa和29 kDa。当菌液D<,600nm>值为0.6时加入终浓度为0.1～1 mmol/L的IPTG在28～37℃诱导4 h，目的蛋白产量很高，占菌体总蛋白的25％以上，且以包涵体形式存在。重组蛋白在变性条件下，经一步Co-IMAC金属螯合层析纯化后，通过SDS-PAGE分析表明目的蛋白的纯度可达80％以上。ELISA结果显示，重组蛋白TvCP3和TvCP3C纯化产物免疫小鼠4次后血清抗体效价分别达1∶204 800和1∶102 400，Western blot显示小鼠高免血清能特异性识别表达产物中的目的蛋白，并且也能特异性识别阴道毛滴虫虫体或分泌物中特异性抗原带，分子质量约为24 kDa。Western blot也显示，小鼠抗TvCP3和TvCP3C高免血清与人成纤维细胞抗原、弓形虫抗原、酵母细胞抗原等不发生印迹反应，与氨基酸序列分析结果相一致。 总之，TvCP组成一个蛋白酶家族，家族内各成员的序列呈现丰富的保守性和多态性，共同组成蛋白酶异构体；在保持酶分子多样性的同时，酶活性位点及相邻位置上的氨基酸残基却高度保守，成熟酶分子的N末端和C末端序列也相当保守；推测TvCP家族各成员可能由一个共同的祖先基因分子进化而来，在保持酶基本功能的同时又赋予酶多样的功能，这为今后TvCP的分子进化分析等提供了理论依据。成功克隆了TvCP3基因，所构建的原核表达载体pET28b-Tvcp3和pET28b-Tvcp3C可在E. coli BL21(DE3)中高效表达，纯化的表达产物具有良好的免疫原性，可使免疫小鼠产生高滴度抗体，高免血清能够识别阴道毛滴虫虫体或分泌物中特异性抗原组分，从而为今后TvCP功能研究和应用打下了良好基础。