研究背景:正常的关节软骨是一种不均一的分层组织,这种分层结构对维持关节软骨的结构和功能至关重要。自体软骨移植被认为是治疗软骨缺损最常用而且最有效的手段。但是,自体软骨细胞移植并未将关节软骨不同层之间的天然差异加入考虑。最近越来越多的研究着重于再生分层软骨,而不只是再生均一一致的软骨组织。使用不同层的软骨细胞再生相应的分层是其中一种手段之一。不同层的软骨细胞能够通过组织学水平分离,并且能够在体外维持一定的分层特性。在体外研究中发现使用不同层软骨细胞分别再生相应层的软骨组织能够维持不同层相应的特性。但是不同层的软骨细胞在体外短暂单层培养扩增就失去其原有的分层特性,而且很难再次重新获得这种分层特性。那些使用不同层软骨细胞修复软骨损伤的研究,均采用低代扩增或者未扩增的不同层软骨细胞。然而,临床上原代软骨细胞必须通过几代扩增后才能获得足够的数量。因此,需要一种方法能够使用较少的短暂扩增或者未扩增的不同层软骨细胞来再生分层软骨。软骨细胞和间充质干细胞共培养修复软骨损伤,被证明是一种有望代替单纯软骨细胞修复软骨损伤的手段。从关节非负重区获得的低代扩增或者未扩增的软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养被证明能够产生与单独软骨细胞成软骨相似的效果。因此,这种方法可以减少软骨细胞的需求数量,这样就可以使用短暂扩增甚至不扩增的软骨细胞用来修复软骨损伤,而这些细胞由于没有去分化过程,所以仍维持分层特性。此外,使用共培养技术时,由于可能不需要软骨细胞扩增,所以软骨损伤修复甚至可以变成一步操作。但是,不同层的软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养后,两者是否能够一起维持不同层的特性仍然不明确。在这篇研究中,我们使用一种常用的体外三维培养体系,海藻酸钠水凝胶体外培养体系,用来研究不同层的软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养后,在体内外是否仍能够维持其不同层的特性。第一部分不同层软骨细胞的分离和体外单层培养环境下分层特性的维持目的:1.提取表层和中深层软骨细胞;2.验证原代表层和中深层软骨细胞之间的基因表达、蛋白合成和增殖速度的差异;3.检测传代后的表层和中深层软骨细胞之间基因表达、蛋白合成和增殖速度的差异;4.分离并验证骨髓间充质干细胞。方法:使用显微取皮刀提取1月龄新西兰兔膝关节股骨面表层约100um厚的软骨组织作为表层软骨细胞来源,剩下的软骨组织作为中深层软骨细胞来源。通过二型胶原酶消化获得原代的表层和中深层软骨细胞。抽取1月龄新西兰兔股骨及胫骨内骨髓,利用骨髓间充质干细胞贴壁的特性分离获得骨髓间充质干细胞。贴壁的骨髓间充质干细胞通过多向诱导证明其多项分化能力。对原代表层和中深层软骨细胞(p0代)进行col2a、acan和prg4基因检测,以gapdh作为内参,使用2-ΔΔct方法进行相对比较。并且将原代表层和中深层软骨细胞加到96孔板中进行单层培养细胞增殖实验。第3、5、7、10天,使用cck-8(cellcountingkit-8)检测增殖率。原代表层和中深层软骨细胞长至90%融合时定义为p1代,以此类推,对p1和p2代同样进行基因和蛋白质水平的检测,并进行增殖速度的检测。结果:发现原代表层和中深层软骨细胞之间存在明显差异,即表层软骨细胞表达更高的prg4基因和col2a基因,中深层软骨细胞表达更高的acan基因。体外单层培养增殖实验发现,中深层软骨细胞增殖速度更快。然而体外扩增一代后,增殖速度差异消失,而基因表达和蛋白水平的差异逐渐缩小,p2代时差异消失。抽取的骨髓贴壁的细胞呈现成纤维细胞样。而扩增后到第三代的骨髓间充质干细胞能够被诱导向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞方向。结论:1.通过组织学分离的p0代表层软骨细胞和中深层软骨细胞呈现不同的特性;2.随着传代,不同层软骨细胞的基因表达、蛋白水平和增殖速度差异逐渐消失。第二部分不同层软骨细胞与骨髓间充质干细胞体外三维共培养环境下细胞外基质成分的变化目的:1.体外使用海藻酸钠水凝胶三维培养体系将表层和中深层软骨细胞分别与骨髓间充质干细胞共培养;2.检测不同时间点(第1、7、21天)时软骨细胞外基质成分的基因表达情况;3.检测不同时间点(第1、7、21天)时软骨细胞外基质主要成分(gag)含量、dna含量变化以及lubricin分泌情况。方法:将p0代表层或中深层软骨细胞单独或与骨髓间充质干细胞以1:2比例混合后,按6×106/ml细胞浓度和2%海藻酸钠混合,使用注射器一滴一滴将海藻酸钠水凝胶滴入到凝固液(102mm氯化钙)中形成凝固的小珠,加入到成软骨诱导培养基中培养。于第1、7、21天时收获小珠。分别检测基因表达情况和gag、dna含量。取培养第1、7、21天的培养24小时的上清用elisa法测量lubricin浓度。结果:基因表达方面第1天和第7天时,中深层软骨细胞共培养组相比于表层软骨细胞共培养组表达更高的acan基因,更低的prg4基因,而col2a水平无明显差异。不同层软骨细胞组之间也有同样的趋势。培养第7天时中深层软骨细胞共培养组和中深层软骨细胞组分别比表层软骨细胞共培养组和表层软骨细胞组沉积更多的gag含量。但是到体外培养的后期(21天),我们所检测的基因表达和gag含量等都无明显差异。尽管单纯分层软骨细胞组相比于相应的共培养组沉积更多的gag含量(以dna标准化),但是当以初始加入的软骨细胞数量标准化后,第7天时,共培养组相比于相应单纯软骨细胞组沉积相似的gag含量。而第21天时,以初始加入的软骨细胞数量标准化后,共培养组相比于相应单纯软骨细胞组反而沉积更多的gag含量。类似的是,早期(第1、7天)表层软骨细胞组和表层软骨细胞共培养组分别相比于中深层软骨细胞组和中深层软骨细胞共培养组分泌更多的lubricin。但是体外培养第21天时,软骨细胞组和软骨细胞共培养组之间的lubricn浓度无明显差异。结论:1.表层和中深层软骨细胞分别与骨髓间充质干细胞共培养后能够在体外三维培养早期(第1、7天)维持不同层软骨细胞的分泌细胞外基质的能力;2.但是随着体外培养时间的延长(21天),这种分泌细胞外基质能力的差异逐渐消失。第三部分不同层软骨细胞与骨髓间充质干细胞三维共培养小珠裸鼠皮下植入后细胞外基质成分的变化目的:1.将海藻酸钠水凝胶三维共培养小珠植入裸鼠皮下异位成软骨;2.分别在第2、8周时,处死裸鼠,进行组织学和生物化学检测(DNA和GAG定量)。方法:将海藻酸钠凝胶小珠分别植入到14只4-6周龄裸鼠皮下。分别于第2周和第8周处死裸鼠,取出海藻酸钠小珠,进行DNA和GAG定量以及免疫荧光等检测。结果:与体外培养相似,体内第2周时,中深层软骨细胞共培养组相比于表层软骨细胞共培养组沉积更多的GAG。以初始加入的软骨细胞数量标准化后,第2周时共培养组相比于相应单纯软骨细胞组反而沉积更多的GAG成分。免疫荧光结果显示,体内第2周时表层软骨细胞组和表层软骨细胞共培养组分别相比于中深层软骨细胞组和中深层软骨细胞共培养组表达更高水平的Lubricin。但是二型胶原免疫荧光染色的荧光信号强度却没有明显差异,这也与体外实验结果相符合。与体外培养不完全一样的是,体内培养后期(第8周),共培养组和单纯软骨细胞组都沉积了相似的GAG成分(以DNA标准化)。而以初始加入的软骨细胞数量标准化后发现,共培养组沉积的GAG含量明显高于单纯软骨细胞组。此外,体内培养第8周时免疫荧光染色结果发现在共培养组之间Lubricin和二型胶原荧光信号无明显差异。同时通过荧光观察发现,体内培养相比于体外培养呈现出更为明显的细胞与细胞之间的直接接触。结论:1.表层软骨细胞共培养组和中深层软骨细胞共培养组在体内成软骨早期(第2周),能够维持细胞外基质分泌能力的差异;2.在体内成软骨后期(第8周),共培养组之间细胞外基质成分分泌能力的差异消失。