第一部分 宫内开始长期的MVAD对AD小鼠老年斑的影响及机制研究　　目的：探讨宫内开始长期的MVAD对AD小鼠老年斑形成和学习记忆功能的影响;以及MVAD对APP代谢通路的影响机制。　　方法：通过给予VAN和MVAD饲料;在APP/PS1双转基因AD小鼠基础上建立从宫内开始长期的 VAN和 MVAD模型;断乳后通过半定量PCR方法鉴定APP和PS1基因;筛选出AD小鼠用于后续实验。VAN和MVAD组小鼠6月龄时进行Morris水迷宫行为学测试;检测小鼠的空间学习和记忆功能;测试结束后断头取血和脑;进行以下检测：采用 HPLC 方法检测血清视黄醇浓度;免疫组化以及体视学方法检测脑组织老年斑的数目和总体积;并对血清视黄醇浓度与老年斑进行Pearson相关性分析;ELISA方法检测脑组织Aβ40和Aβ42含量;western blot方法检测脑组织APP切割产物C99、C89和C83蛋白水平;real-time PCR和western blot方法分别检测脑组织APP代谢通路相关基因和蛋白的表达;包括APP、ADAM10、BACE1和PS1;以及RARα、RARβ和RARγ基因和蛋白的表达水平。　　结果：（1）成功鉴定APP和PS1基因;筛选出双转基因小鼠;（2）血清视黄醇浓度检测：MVAD组小鼠血清视黄醇浓度显著低于VAN对照组（ P<0.001 ）;且雌性小鼠的血清视黄醇浓度显著低于雄性小鼠（P<0.001）;（3）水迷宫行为学测试：MVAD 组小鼠的空间学习和记忆功能显著差于VAN组（P<0.001）;不同性别小鼠之间没有显著差异（P>0.05）;（4）脑组织老年斑的数目和总体积：MVAD组雄性小鼠老年斑的数目显著多于 VAN 组（P<0.05）;但雌性小鼠两组间的变化不显著（P>0.05）;无论是雄性还是雌性小鼠;MVAD组老年斑的总体积均显著大于 VAN 组（P<0.05）;此外;雌性小鼠老年斑的数目和总体积均显著多于雄性小鼠（P<0.001）;（5）血清视黄醇浓度与脑组织老年斑的相关性：血清视黄醇浓度与老年斑的数目和总体积均呈显著负相关（P<0.01和P<0.01）;（6）脑组织Aβ40和Aβ42含量：MVAD组小鼠Aβ40和Aβ42含量均显著多于VAN组（P<0.01和P<0.05）;（7）脑组织APP切割产物的含量：MVAD组小鼠BACE1切割APP产生的C99蛋白显著增加（P<0.01）;而由BACE1和α-分泌酶分别切割APP产生的 C89 和 C83 蛋白在两组间没有显著差异（P>0.05 和 P>0.05）;（8）脑组织APP代谢通路相关基因和蛋白的表达：MVAD组小鼠APP和BACE1蛋白表达显著增加（P<0.001和P<0.05）;ADAM10蛋白表达显著减少（P<0.01）;而PS1-FL和PS1-NTF蛋白表达在两组间没有显著改变（P>0.05和P>0.05）;这些蛋白在mRNA水平上均没有显著差异（P>0.05）;（9）脑组织RARα、RARβ和RARγ基因和蛋白的表达：RARα、RARβ和RARγ蛋白和mRNA表达水平在两组间均未见显著差异（P>0.05）。　　结论：（1）在APP/PS1双转基因小鼠的基础上;成功建立了从宫内开始长期的MVAD模型;（2）从宫内开始长期的MVAD在转录后水平上调APP和β-分泌酶（BACE1）的表达;增加BACE1切割APP;同时下调α-分泌酶的核心组成部分ADAM10的表达;从而增加Aβ的产生和老年斑的形成;加重学习记忆功能障碍;（3）雌性 AD 小鼠老年斑的沉积多于雄性小鼠;可能与VA水平降低有关;但性别对学习记忆功能没有显著影响。　　第二部分 宫内及生后早期VA营养对AD小鼠成年期学习记忆功能的影响　　目的：探讨宫内MVAD对AD模型小鼠成年期学习记忆功能的远期影响;明确不同剂量VA补充对宫内MVAD所致的损伤是否有逆转作用;并通过不同时期VA补充;探讨VA干预治疗的最佳时间窗。　　方法：（1）建立不同时期的 MVAD 模型：在 APP/PS1 双转基因AD小鼠中;建立不同时期的MVAD小鼠模型;分别是宫内MVAD但出生后VAN的MVAD-N组、以及宫内VAN但出生后MVAD的VAN-M组;（2）建立不同剂量的VA补充模型：分别是宫内MVAD出生后给予VAN母乳和饲料的MVAD-N组、以及出生后给予3倍推荐摄入量的VA制剂灌胃7天同时给予VAN母乳和饲料的MVAD-S0组;（3）建立不同时期的VA补充模型：分别在宫内MVAD小鼠出生后4天、1月、2月给予3倍推荐摄入量的VA制剂灌胃7天同时给予VAN母乳和/或饲料;即MVAD-S0组、MVAD-S1组和MVAD-S2组。所有分组雄性小鼠用于实验;在6月龄时;采用Morris水迷宫行为学方法检测各组小鼠的空间学习和记忆功能;采用 HPLC 方法检测血清视黄醇浓度;采用ELISA方法检测脑组织Aβ40含量;采用western blot方法检测VAN组、MVAD-N组和VAN-M组小鼠脑组织APP和BACE1蛋白的表达。　　结果：（1）不同时期 MVAD 小鼠成年期情况：1）视黄醇浓度：MVAD-N组血清视黄醇浓度与VAN组相当（P>0.05）;VAN-M组血清视黄醇浓度则显著低于VAN组和MVAD-N组（P<0.001和P<0.001）;2）学习记忆功能：MVAD-N组小鼠的学习记忆功能显著差于VAN组（P<0.05）;而VAN-M组与VAN组之间未见显著差异（P>0.05）;3）脑组织APP、BACE1蛋白表达：MVAD-N组APP和BACE1蛋白表达较VAN组显著增加（P<0.01和P<0.01）;而VAN-M组与VAN组之间没有显著差异（P>0.05和P>0.05）;4）脑组织Aβ40含量：MVAD-N组Aβ40显著多于VAN组（P<0.01）;而VAN-M组与VAN组之间未见显著差异（P>0.05）;（2）不同剂量的VA补充小鼠成年期情况：1）视黄醇浓度：MVAD-N 组和 MVAD-S0 组血清视黄醇浓度均显著高于MVAD组（P<0.01和P<0.01）;且与VAN组水平相当;2）学习记忆功能：MVAD-N组小鼠的学习记忆功能与MVAD组接近;且显著差于VAN组（P<0.05）;而MVAD-S0组小鼠的学习记忆功能显著好于MVAD组和MVAD-N组（P<0.001和P<0.05）;且与VAN组相当;3）脑组织Aβ40含量：MVAD-N组Aβ40与MVAD组之间没有显著差异（P>0.05）;却显著多于VAN组（P<0.01）;而MVAD-S0组Aβ40显著少于MVAD组（P<0.001）;与 VAN 组之间没有显著差异（P>0.05）;（3）出生后不同时期的VA补充小鼠成年期情况：1）视黄醇浓度：MVAD-S0组、MVAD-S1 组和 MVAD-S2 组血清视黄醇浓度均显著高于 MVAD 组（P<0.01、P<0.01和P<0.01）;且与VAN组水平相当;2）学习记忆功能：MVAD-S0 组、MVAD-S1 组和 MVAD-S2 组小鼠的学习记忆功能均显著好于MVAD组;且MVAD-S0组与MVAD组之间的差异最显著（P<0.001、P<0.05和P<0.05）;此外;三组小鼠的学习记忆功能逐渐向VAN组靠近;且MVAD-S0组与VAN组最相近;3）脑组织Aβ40含量：MVAD-S0 组、MVAD-S1 组和 MVAD-S2 组 Aβ40 均显著少于MVAD 组;且 MVAD-S0 组 Aβ40 减少最显著（P<0.001、P<0.01 和P<0.01）;MVAD-S0组与VAN组最接近。　　结论：（1）宫内MVAD通过增加APP和BACE1的表达;从而增加 Aβ 的形成;加重学习记忆功能缺损;且损害程度较出生后 MVAD更显著;（2）出生时开始给予 VAN饮食;虽能使 MVAD小鼠成年期的VA水平恢复正常;却不能减缓MVAD引起的学习记忆功能缺损和Aβ增加;（3）生后早期不同发育阶段给予3倍推荐摄入量的VA制剂连续补充7天、同时开始给予VAN饮食;不但可以使MVAD小鼠成年期的VA水平恢复正常;还可以减缓MVAD引起的学习记忆功能缺损和Aβ增加;而且;干预越早;效果越好。　　第三部分 RA信号通路调节APP代谢通路的体外机制研究　　目的：研究激活或抑制RARs介导的RA信号通路对APP代谢通路和Aβ形成的影响。　　方法：（1）使用RARs激动剂ATRA和拮抗剂BMS493分别处理不同的细胞系：○1 20E2细胞：过表达人APPswe的HEK293细胞系、○2 2EB2 细胞：过表达人 APPswe 和 BACE1 的 HEK293 细胞系、○3 SH-SY5Y细胞、○4 SH-APPs细胞：过表达人APPswe的SH-SY5Y细胞系;采用SqRT-PCR和western blot方法检测RARα、RARβ和RARγ基因和蛋白表达水平;ELISA方法检测20E2和2EB2细胞Aβ40和Aβ42含量;western blot检测APP代谢通路中相关蛋白（APP、APP-CTFs、ADAM10、BACE1、PS1）的水平;（2）使用 L-685;458、MG132 和CHL 分别抑制 γ-分泌酶、蛋白酶体和溶酶体活性;western blot 检测ATRA和BMS493处理20E2细胞后APP-CTFs蛋白的水平;（3）使用Genomatix在线软件的MatInspector工具对人APP和BACE1基因转录起始位点上游5001 bp的序列进行RAR/RXR转录因子结合位点分析;（4）利用基因工程方法构建RARE荧光素酶报告质粒（pGLpL-RARE）以及RARα、RARβ和RARγ表达质粒（pZ-RARα、β、γ）;并进行酶切鉴定和测序;pZ-RARα、β、γ表达质粒转染HEK293细胞;western blot进行蛋白表达鉴定;pZ-RARα、β、γ表达质粒和pGLpL-RARE或APP启动子荧光素酶报告质粒（phAPP 2.94）或BACE1启动子荧光素酶报告质粒（pB1p-A-2634/400）共转染HEK293细胞;并使用ATRA进行干预;采用双荧光素酶报告分析系统检测荧光素酶活性;（5）20E2或 2EB2 细胞与小胶质细胞 BV2 以不同比例共培养;使用 ATRA 和BMS493处理后;ELISA方法检测培养基中Aβ40和Aβ42的含量;（6）使用带绿色荧光的Aβ42聚合物（Aβ42G）处理BV2和HEK293细胞;荧光显微镜下观察荧光在细胞中的位置。　　结果：（1）ATRA和BMS493处理20E2和2EB2细胞后RARs基因和蛋白的表达：ATRA和BMS493可分别激活和抑制RARα、RARβ和RARγmRNA表达（P<0.05）;而蛋白水平除了RARβ没有显著差异外;RARα和RARγ蛋白表达与基因水平一致;（2）ATRA和BMS493处理20E2和2EB2细胞后Aβ和APP代谢通路相关蛋白的表达：ATRA处理后;Aβ40和Aβ42显著增加（P<0.05）;APP、APP-CTFs和BACE1蛋白也显著增加（P<0.05）;BMS493 处理则显著降低 Aβ40、Aβ42、APP、APP-CTFs和BACE1蛋白水平（P<0.05）;而ATRA和BMS493处理后ADAM10和PS1蛋白表达没有显著差异（P>0.05）;（3）ATRA和 BMS493 处理 20E2 细胞同时抑制 γ-分泌酶/蛋白酶体/溶酶体后APP-CTFs的变化：ATRA处理显著增加C99和C83蛋白水平（P<0.05）; BMS493处理则显著降低C99和C83蛋白水平（P<0.05）;（4）ATRA和BMS493处理SH-SY5Y和SH-APPs细胞的结果与20E2和2EB2细胞的结果相似;（5）APP和BACE1启动子上RAR/RXR转录因子结合位点的分析：APP和BACE1启动子上分别有5和4个RAR/RXR转录因子结合位点;（6）通过酶切鉴定和测序证实pGLpL-RARE荧光素酶报告质粒以及pZ-RARα、β和γ表达质粒构建成功;而且pZ-RARα、β和γ表达质粒可以分别显著增加RARα、RARβ和RARγ的表达;（7） ATRA处理和RARα、β、γ过表达后RARE的活性：ATRA处理和RARα、β、γ过表达可以显著增加RARE活性（P<0.05）;且RARα、β、γ过表达显著增加ATRA对RARE活性的激活作用（P<0.05）;（8）ATRA处理和RARα、β、γ过表达后APP和BACE1启动子的活性：ATRA处理和 RARα、β、γ 过表达对 APP 启动子的活性均未产生显著影响（P>0.05）;而ATRA处理及RARα、β过表达均未对BACE1启动子活性产生显著影响（P>0.05）;仅RARγ过表达降低BACE1启动子活性（P<0.05）;（9）ATRA和BMS493处理20E2或2EB2细胞与小胶质细胞BV2共培养后Aβ40和Aβ42的含量：ATRA处理显著降低共培养上清中的Aβ40和Aβ42水平（P<0.05）;BMS493处理则显著增加共培养上清中的Aβ40和Aβ42水平（P<0.05）;此外;小胶质细胞BV2显著减少20E2和2EB2产生的Aβ40和Aβ42;（10）Aβ42G处理BV2和HEK293细胞后的荧光：绿色荧光只出现在BV2胞浆中;HEK293胞浆中未见荧光。　　结论：（1）ATRA通过激活RA信号通路;上调20E2和2EB2细胞APP和BACE1的表达;从而增加Aβ的产生;相反;BMS493通过抑制RA信号通路;下调APP和BACE1的表达;从而减少Aβ的产生;然而;当这些分泌Aβ的细胞与小胶质细胞共培养来模拟体内复杂环境时;ATRA和BMS493分别减少和增加共培养上清中的Aβ;说明RA信号通路在体内复杂环境中能更好的发挥作用;小胶质细胞在 RA 信号通路介导的 Aβ 清除中起了重要作用;（2）ATRA 和 BMS493 对ADAM10 和 PS1 的表达、以及对 γ-分泌酶、蛋白酶体和溶酶体降解APP-CTFs的作用均没有显著影响;（3）APP和BACE1启动子上含有RAR/RXR转录因子结合位点;但除了RARγ过表达降低BACE1启动子活性外;ATRA和RARα、β均未引起APP和BACE1启动子活性的改变。