目的:原发性干燥综合征（primary Sj（?）gren’s syndrome,p SS）是一种以外分泌腺淋巴细胞浸润和血清中存在多种自身抗体为特征的常见的慢性系统性自身免疫性疾病,主要表现为口干和眼干。研究发现p SS患者唾液腺中除了存在大量淋巴细胞浸润外同时存在脂肪组织浸润,且唾液腺的破坏常常伴随着脂肪组织的发展,这表明脂肪细胞可能参与了p SS的发病机制。虽然p SS的发病机制尚不十分明确,但是已有大量报道表明炎症和凋亡在腺体损伤中发挥了重要作用。因此探索减轻腺体炎症和凋亡的治疗方法对减轻p SS患者腺体损伤有着重要的意义。槲皮素（Quercetin,QU）,是一种存在于许多水果、蔬菜、叶子和谷物中的黄酮醇类化合物。QU对于炎症、免疫及凋亡具有调节作用。据报道,QU能减轻辐射造成的唾液腺损伤,减少唾液流率的降低,提高水通道蛋白5（Aquaporin 5,A QP5）和毒蕈碱受体3（Muscarinic receptor 3,M3R）的表达。但是QU在p SS唾液腺损伤中是否起治疗作用还未见报道。因此,QU是否能够减轻p SS唾液腺损伤并起到调节唾液腺凋亡和炎症的作用值得进一步研究。瘦素（Leptin,LP）属于白色脂肪组织分泌的脂肪因子,其在代谢及能量平衡方面发挥着多种生理作用。有报道称,LP信号通路参与p SS的发病机制,拮抗LP受体（OB-R）会减轻p SS唾液分泌减少和淋巴细胞浸润。LP信号常常是通过与OB-R结合,激活其主要下游通路酪氨酸激酶/信号转导和转录激活因子（janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT）而发挥作用的。有研究表明LP激活的OB-R及其下游的JAK/STAT信号通路可介导唾液腺内皮细胞的凋亡和炎症。而QU可下调肥胖引起的LP水平的升高及人脐静脉内皮细胞中LP诱导的OB-R的表达。并且QU已被证明能通过下调JAK/STAT信号通路影响细胞的凋亡和炎症。综上,我们推断Q U可能通过对LP信号通路的抑制,从而发挥对于唾液腺凋亡和炎症的改善作用。本研究主要探讨QU能否减轻p SS唾液腺损伤,改善唾液腺凋亡和炎症,探寻其机制并在IFN-γ诱导的体外模型中验证LP信号通路的参与。研究方法:第一部分:选择雌性BALB/c小鼠作为对照组,雌性NOD/Ltj小鼠作为SS动物模型。将动物分为对照组、SS组、SS+QU-L组和SS+QU-H组,每组12只。所有小鼠（7周龄）在分组给药前适应性喂养1周。NOD/Ltj小鼠分别灌胃50mg/kg QU（SS+QU-L）或100mg/kg QU（SS+QU-H）,每天1次,连续8周,至16周龄。在给药组中,QU溶解在二甲基亚砜（DMSO）中。对照组BALB/c小鼠和SS组NOD/Ltj小鼠均给予与给药组相同体积的DMSO,每日灌胃,连续8周。通过腹腔注射戊巴比妥钠（50mg/kg体重）麻醉小鼠,然后通过腹腔注射无菌异丙肾上腺素（20μg/100g体重）刺激小鼠唾液分泌。采集唾液前对干棉签进行称重,用棉签收集口腔唾液10分钟,然后再次称重。收集的唾液体积标准化为相应的小鼠体重（g）,并表示为:mg/g/10min。监测各组小鼠在给药过程中唾液流率的变化（0,2,4,6,8周）。HE染色检测各组小鼠颌下腺（submandibular gland,SMG）组织及组织学评分。Western blot检测各组小鼠SMG组织中唾液分泌标记物AQP5和M3R的蛋白表达情况。第二部分:TUNEL染色检测各组小鼠SMG组织的细胞凋亡水平。Western blot检测各组小鼠SMG组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3及Cleaved Caspase-3的蛋白水平。Real-time PCR检测各组小鼠SMG组织中TNF-α、IL-6及IL-1β的转录水平。Western blot检测各组小鼠SMG组织中TNF-α,IL-6及IL-1β的蛋白水平。第三部分:ELISA检测各组小鼠血清中LP水平。Real-time PCR检测各组小鼠SMG组织中LP及OB-R的转录水平。Western blot检测各组小鼠SMG组织中LP、OB-R、JAK2、p-JAK2、STAT3及p-STAT3的蛋白水平。分离并培养小鼠唾液腺上皮细胞（salivary gland epithelial cells,SGECs）后,应用免疫荧光鉴定SGECs。采用MTT法测定QU对细胞活力无显著影响的最大浓度。使用IFN-γ、LP、IFN-γ+LP、IFN-γ+QU和IFN-γ+QU+LP处理细胞后,收集细胞,TUNEL染色检测细胞的凋亡情况。Western blot检测各组细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、LP、OB-R、JAK2、p-JAK2、STAT3及p-STAT3的蛋白水平。Real-time PCR检测各组细胞中TNF-α、IL-6、LP及OB-R的转录水平。结果:第一部分:SS小鼠的唾液流率随着时间的推移而降低,到第8周时明显低于对照组（P＜0.01）,高剂量QU给药后（8周）唾液流率显著恢复（P＜0.01）。HE染色检测各组小鼠SMG组织的组织病理学变化,结果示SS组炎性细胞浸润明显增加,而给予QU后可使炎性细胞大量减少,尤其是高剂量给药组,组织形态较SS组更致密、正常。不同组SMG组织的组织学评分与这些形态学改变一致。Western blot结果显示,SS小鼠SMG组织中唾液分泌相关蛋白AQP5和M3R的表达水平显著降低,而QU处理后上述蛋白表达明显升高（P＜0.01）。第二部分:TUNEL染色结果表明SS组小鼠SMG组织的凋亡细胞比例相比于对照组明显升高（P＜0.001）,而给予QU后凋亡细胞比例明显下降（P＜0.05）。Western blot结果显示SS组小鼠SMG组织中Bcl-2下降,而Bax和Cleaved Caspase-3/Caspase-3升高,给予QU可逆转这些效应,导致Bcl-2升高,Bax和Cleaved Caspase-3/Caspase-3降低。Real-time PCR结果显示SS组小鼠SMG组织中的TNF-α、IL-6和IL-1β的m R NA水平显著升高（P＜0.001）,给予QU后上述促炎细胞因子的m RNA水平明显下降,尤其是SS+QU-H组（P＜0.001）。Western blot结果显示SS组小鼠SMG组织中的TNF-α、IL-6和IL-1β的蛋白水平亦明显升高（P＜0.001）,给予QU后上述促炎细胞因子的蛋白水平明显下降,特别是SS+QU-H组（P＜0.001）。第三部分:ELISA结果示SS组小鼠血清LP水平显著升高（P＜0.001）,而在QU给药组中其水平明显降低（P＜0.001）。Real-time PCR结果示各组小鼠SMG组织中LP的m RNA水平无显著差异,而在SS组小鼠SMG组织中OB-R（OB-Ra和OB-Rb）的m RNA表达水平显著升高（P＜0.001）,在给予QU组OB-R的m RNA表达水平明显降低,尤其在SS+QU-H组（P＜0.001）。Western blot结果显示各组小鼠SMG组织中LP的蛋白水平无显著差异,而在SS组小鼠SMG组织中OB-R（OB-Ra和OB-Rb）的蛋白表达水平显著升高（P＜0.001）,在给予QU组OB-R的蛋白表达水平明显降低（P＜0.001）。SS组小鼠SMG组织中JAK2、p-JAK2、STAT3及p-STAT3的蛋白水平相比于对照组明显升高（P＜0.001）,而在给予QU后上述指标的蛋白表达水平明显下降,特别是在SS+QU-H组（P＜0.05）。免疫荧光结果显示SGECs角蛋白14、角蛋白18、p63等上皮细胞标记物为阳性,而肌上皮细胞标记物α-SMA为阴性,因而识别出SGECs。MTT法检测QU对细胞活力的影响,结果表明100μM QU是对SG ECs细胞活力无统计学显著影响的最大浓度,然后用100μM QU处理细胞进行后续实验。SGECs的TUNEL染色显示IFN-γ诱导的细胞凋亡相比于对照组明显增加（P＜0.001）,给予LP后细胞凋亡再次增加（P＜0.05）,而给予QU后细胞凋亡显著减少（P＜0.001）。Western blot结果示IFN-γ组细胞中Bcl-2的蛋白水平相比于对照组明显下降（P＜0.001）,加用LP后其表达水平再次下降（P＜0.05）,而给予QU后其表达水平显著升高（P＜0.01）。Bax和Cleaved Caspase-3/Caspase-3结果与之相反。Real-time PCR结果示IFN-γ组细胞中TNF-α、IL-6的m RNA水平显著高于对照组（P＜0.001）,加用LP后其表达水平再次升高（P＜0.001）,而给予QU后其表达水平明显下降（P＜0.01）。IFN-γ组细胞中OB-R（OB-Ra和OB-Rb）的m RNA水平相比于对照组明显升高（P＜0.001）,加用LP后其表达水平再次升高（P＜0.01）,而给予QU后其表达水平明显下降（P＜0.01）。Western blot结果示IFN-γ组细胞中O B-R（OB-Ra和OB-Rb）的蛋白水平相比于对照组明显升高（P＜0.001）,加用LP后其表达水平再次升高,而给予QU后其表达水平明显下降（P＜0.05）。IFN-γ组细胞中JAK2、p-JAK2、STAT3及p-STAT3的蛋白水平相比于对照组明显升高（P＜0.01）,加用LP后其表达水平再次升高（P＜0.01）,而给予QU后其表达水平显著下降（P＜0.05）。结论:1、QU在p SS唾液腺损伤中具有保护作用,可以减轻p SS唾液腺损伤。2、QU可以减轻p SS模型小鼠SMG组织的凋亡和炎症。3、其作用机制可能是QU通过调节LP/OB-R信号通路来减轻p SS唾液腺损伤。