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迄今为止发现许多复杂的芳香化合物经过多步代谢后进入龙胆酸途径进行降解,而且在许多属的细菌中也发现存在龙胆酸途径,但是对它的研究大多数集中于革兰氏阴性细菌,在革兰氏阳性细菌中尤其是低G+C含量的芽胞杆菌中的研究相对较少。本研究选取低G+C含量的芽胞杆菌,对其中的龙胆酸途径进行研究。
嗜碱性耐盐芽胞杆菌C-125是一株经过全基因组测序的嗜碱性芽胞杆菌。本研究利用分子生物学方法将其基因组中参与龙胆酸代谢的基因簇(基因BH2000-BH2005)进行了功能鉴定:BH2002和BH2004都编码龙胆酸1,2-双加氧酶,BH2001编码依赖巯基化合物的顺丁烯二酸单酰丙酮酸异构酶,BH2000编码反丁烯二酸单酰丙酮酸水解酶,而BH2003和BH2005的功能未知。龙胆酸在BH2002/BH2004,BH2001和BH2000的顺序催化下分解为反丁烯二酸和丙酮酸进入三羧酸循环。研究表明,其中的顺丁烯二酸单酰丙酮酸异构酶BH2001可以依赖半胱氨酸Cys、半胱氨酰谷氨酸CG、Υ-谷氨酰半胱氨酸Υ-GC、CoA和还原型谷胱甘肽GSH五种不同的巯基化合物作为辅因子。CG作为辅因子与酶的亲和力最高(Km=4.69μM),Cys次之(Km=17.15μM)。而C-125菌株细胞内巯基化合物Cys的含量0.18μmol/g,CG为0.046μmol/g,说明在生理状态下Cys作为BH2001的辅因子。BH2001对底物顺丁烯二酸单酰丙酮酸的动力学参数为Km=80.6μM,Vmax=90.4μM min-1。该酶的最适pH为8.5,在55℃水浴处理4小时后仍残余60%的活性,说明其具有良好的耐热性。0.2mM的多种二价金属离子对BH2001酶活均有不同程度的抑制,该酶经过邻菲哕啉螯合后,与0.02mMNi2+温育,BH2001酶活有明显回复,并且不同辅因子作用下酶活提升的幅度不同,其中Cys提升的幅度为198%。C-125菌株细胞粗酶液对单羟基苯甲酸化合物也具有催化活性,却不能利用这些化合物及龙胆酸进行生长。推测C-125菌株中可能缺少一种芳香酸转运蛋白。利用用原生质体融合再生方法尝试将功能已经鉴定的芳香酸转运蛋白转入C-125菌株中,但未得到阳性结果。本研究在为龙胆酸代谢多样性提供新的理论依据的同时也使得我们对模式菌株C-125有了更进一步的认识。