前言:　　 乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤,是全球女性因癌症死亡的首要原因,其发病率呈逐年上升的趋势。致死原因大多是肿瘤细胞经血道或淋巴道转移至远处器管。其发生发展、浸润转移的分子机制尚未完全阐明。　　 GIV是一个由1870或1871个氨基酸组成的分子量约220kD的细胞内大分子,根据它们的亚基和亚细胞定位分为四个区域:N末端253个氨基酸编码的与微管相互作用的Hook结构域、88个氨基酸组成的介导同源二聚体形成的卷曲螺旋结构域、与Gi的a亚基相互作用的Ga结构域(GBD)及与EGFR、Akt激酶和骨架蛋白相互作用的C末端组成。含Akt磷酸化位点的区域命名为CT1,其它的C末端区域命名为CT2。GIV的C末端的GEF结构域是GIV的一个重要的组成部分,能特异性的结合和活化Gai亚基,活化的Gai释放游离的Gbr亚基,通过Gbr-PI3K途径增强Akt信号。Girdin通过CT1结构域与细胞膜有关,CT2结构域局限到肌动蛋白纤丝上。GIV是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)/AKT信号通路的一个新的组成元件,能够增强Akt的磷酸化,激活的Akt能募集微丝蛋白形成片状伪足,进而影响细胞迁移。在细胞周期中,GIV在重塑肌动蛋白骨架和肿瘤进展中发挥重要作用。GIV现已经成为乳腺癌、结肠癌、肺癌、宫颈癌的备受关注的生物标记。　　 STAT3是近期研究较多的一类关键性的核转录因子,并广泛表达于不同类型的细胞和组织中。正常生理情况下,STAT3的激活是快速而短暂的,对维持细胞的生理功能调节细胞增殖分化至关重要。已研究发现STAT3在头颈部肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤等多种恶性肿瘤组织与细胞系中有异常表达和活性增强,提示STAT3异常表达在肿瘤发生和发展中起重要作用,参与细胞的生长、恶性转化及凋亡等功能的调控。持续性激活还将导致细胞失控性增生,加速血管生成,而在颅内星形胶质细胞瘤细胞系中,利用RNAi技术敲除STAT3基因则可导致细胞出现明显的凋亡表现。由此可以见STAT3是多种肿瘤细胞中细胞因子信号转导途径的接头蛋白(adaptorprotein),实施对STAT3信号转导的干预必将对肿瘤的分化、增殖、凋亡以及血管生成产生重要影响。　　 最近研究发现GIV是与STAT3相互作用的蛋白质,具体的调控机制尚不清楚。我们推测磷酸化的STAT3与GIV的关系更为密切,本文目的旨在探讨乳腺组织及细胞系中STAT3与GIV表达情况及与临床病理参数的意义,探讨在乳腺癌中转染、干扰STAT3功能后GIV表达的变化。　　 材料与方法:　　 1、材料　　 204例乳腺组织标本(包括43例正常乳腺组织,47例乳腺导管原位癌组织和114例乳腺浸涧性导管癌组织),均取自中国医科大学第一临床学院2007-2010年肿瘤外科手术切除的标本,所有患者术前均未接受放、化疗。标本经4%中性甲醛固定,石蜡包埋,HE常规染色后明确诊断。其中部分癌组织和正常乳腺组织离体后立即放入液氮后-70℃冰箱保存备用。　　 2株乳腺癌癌细胞系(MDA-MB-231和MCF-7),1株人乳腺正常上皮细胞系(MCF-10A)。用含10%新鲜胎牛血清的DMEM培养基,在37℃,5%CO2的条件下培养。　　 2、主要试剂和来源　　 Stat3兔多克隆抗体均购自美国SantaCruz公司。P-Stat3和GIV兔多克隆抗体购自美国CellSignal公司和MilliporeInc,SP免疫组化试剂盒和DAB酶底物显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。引物购自生工生物(上海)有限公司,RT-PCR、转染、干扰试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司,引物购自生工生物(上海)有限公司,RT-PCR、转染、干扰试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。　　 3、方法　　 (1)免疫组织化学染色及结果判定　　 标本固定,石蜡包埋,制成4μm连续切片,采用链菌素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法(S-P法)检测GIV和STAT3蛋白表达。以PBS缓冲液代替一抗为阴性对照。结果判定:P-stat3以细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性显色,GIV、STAT3以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性显色。高倍视野(x400)下选阳性信号最强区域计数200个肿瘤细胞中阳性细胞数,根据免疫组化染色强度分为三个等级:浅黄色计为1分,棕黄色计为2分,黄褐色计为3分。按GIV和P-STAT3表达百分率分为以下四个等级:0%为0分,1%-50%为1分,51%-75%为2分,＞75%为3分。以染色强度和阳性细胞率的分值乘积作为每一例的积分,积分＜4者判定为阴性,积分＞4为阳性。　　 (2)WesternBlot　　 在收集的细胞内加入裂解液充分裂解,低温高速离心(4℃,15000转/min,30min),提取上清为总蛋白。上样蛋白量为60μg。电泳(12%SDS-PAGE凝胶)、转印至PVDF膜、封闭,一抗GIV(1:200)、STAT3(1:200)和β-actin(1:200),4℃孵育过夜,分别与各自对应的二抗(1:4000)室温孵育2小时,ECL显色,结果经自动凝胶成像分析仪采集,进行灰度值测定,β-actin做内参。　　 (3)组织提取RNA及RT-PCR　　 使用Trizol试剂提取细胞总RNA后,逆转录获得cDNA,均按北京全式金公司RT-PCR试剂盒说明书操作进行。(1)每100mg组织加1mlTrizol,冰浴下匀浆;(2)加2001.tl氯仿,充分混匀,室温放置5分钟;(3)120009,4。C,离心10分钟;(4)取上清,加等体积异丙醇,充分混匀,室温放置10分钟;(5)120009.4。C,离心10分钟;(6)去上清,加75%乙醇1ml洗涤沉淀;(7)75009,4℃,离心5分钟,去上清;(8)重复(6)～(7)步骤,超净台上挥发乙醇;(9)沉淀加适量的DEPC处理水,溶解总RNA后,-70℃保存备用;(10)总RNA经紫外分光光度计测定OD260和OD280,两者比值在1.8.2.0之问的RNA纯度为好;(11)反转录使用Oligo(dT)弓1物,合成cDNA条件为:30。C,10分钟;42℃,30分钟;99℃,5分钟;5℃,5分钟。反转录结束后进行PCR反应,反应体系为20p.1。PCR引物经GeneBank上的Blast比对后委托上海生工公司合成,PCR引物序列和反应条件等详细信息见表1。PCR扩增产物使用1.5%琼脂糖,100伏电泳30分钟,EB染色,凝胶成像系统(BioImagingSystem,UVPUSA)观察。以β-actin为内对照。　　 (4)siRNA转染、干扰　　 实验分三组:空白对照组、非特异性siRNA转染组和特异性siRNA转染组,每个实验均重复三次,转染具体步骤按Lipofeet2000试剂说明书进行。　　 4、统计分析　　 采用SPSS17.0统计学分析软件,对P-stat3和GIV表达与临床病理因素的关系用x2检验;P-stat3和GIV表达的关系采用Spearman等级相关分析,采用t检验分析Westernblot图像灰度值。P＜0.05为有统计学意义。　　 结果:　　 1、免疫组织化学结果　　 P-stat3蛋白主要在细胞核表达,GIV蛋白主要在细胞浆表达。在乳腺癌发生过程(正常乳腺组织,导管原位癌,浸润性导管癌)中Ps-tat3和GIV蛋白的阳性表达率呈逐渐升高趋势。两者表达水平均与乳腺癌组织学分级(P＞0.05)无关,GIV与ER(P＜0.05)、PR(P＜0.05),与her-2(P＜0.05)、淋巴结转移(P＜0.05)明显相关。在114例乳腺癌中P-stat3和GIV蛋白表达呈正相关(P＜0.05)。　　 2、RT-PCR和WesternBlot结果　　 P-stat3蛋白和GIV蛋白在乳腺癌组织及细胞系中的表达明显高于正常乳腺组织及细胞系,用STAT3转染乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB231中Stat3的功能　　 后GIV的mRNA和蛋白水平较对照组增强;siRNA干扰乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB231中Stat3的功能后GIV的mRNA和蛋白水平较对照组下降。　　 结论:　　 P-stat3和GIV在乳腺癌发生发展中异常表达,两者之问存在相关性。