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肾间质纤维化是各种慢性肾脏疾病(Chronic kidney disease, CKD)进展到终末期所发生的不可避免的结果。肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化(EMT)被认为是其中重要的事件之一,在EMT的过程中,上皮标志物如E-钙粘蛋白(E-cadherin),闭合蛋白(occludin)等表达下降,甚至丢失。E-cadherin主要与β-连环素(β-catenin)一起形成细胞粘附复合体,介导细胞之间的粘附,β-catenin是重要的E-cadherin表达调节分子,其入核后可激活抑制E-cadherin表达相关基因的启动子(如Snail, Slug等)；occludin则为细胞紧密连接的重要组成蛋白,介导细胞之间的紧密连接,维持上皮细胞的极性,其表达可以通过极性蛋白Par6来调节。有研究表明,转化生长因子-betal (TGF-β1)是重要的促纤维化因子,可通过经典的Smad信号通路和其他非Smad信号通路(包括MAPK, PI3K/Akt, ERK, RhoGTPase等)来完成其对肾间质纤维化的调节作用。本文研究的目的蛋白Cdc42相关蛋白(Cdc42-interacting protein, CIP4)是RhoGTPase蛋白家族成员之一,是Cdc42的下游效应蛋白,参与细胞骨架蛋白肌动蛋白(actin)的调节,对维持细胞正常的形态起重要的作用。我们的研究结果表明：无论在大鼠5/6肾切除模型还是小鼠单侧输尿管结扎(Unilateral ureteral obstruction,UUO)的模型中,与假手术组相比较,CIP4的表达均上调,且主要分布在肾小管侧基底膜,细胞之间的连接处,而E-cadherin和occludin的表达则下降。体外实验我们使用TGF-pl诱导的肾小管上皮细胞作为主要研究对象,CIP4的表达同样上升,并伴随有E-cadherin和occludin表达的下调,与体内实验结果一致。在无TGF-β1的刺激下单独高表达CIP4,亦可出现上述相关蛋白的变化。同时我们还观察到,无论是在TGF-β1的诱导下还是CIP4高表达情况下,β-catenin与CIP4均存在相互作用,但是细胞总蛋白中β-catenin的表达无明显变化,在核蛋白中的表达则增加。使用特异性siRNA敲除CIP4后,核蛋白内β-catenin表达减少,同时E-cadherin表达恢复,甚至高于对照组的表达水平。进一步的研究表明,在高表达CIP4的情况下特异性敲除β-catenin, E-cadherin的表达并无明显的变化。另一方面,在TGF-β1诱导和CIP4高表达的两组细胞中,极性蛋白Par6(Polarity protein, Par6)表达无明显的统计学差异,但这两组细胞中均存在CIP4与Par6的相互作用,但是在对照组细胞内是则未观察到该现象。综上所述,我们发现,CIP4可通过促进β-catenin入核调节E-cadherin的表达,同样,CIP4也可能通过Par6参与occludin表达的调节。第一部分肾间质纤维化模型中CIP4的表达与分布目的探讨在SD大鼠5/6肾切除模型以及Balb/c小鼠UUO模型中CIP4的表达量的变化与分布。方法SD大鼠5/6肾切除法建立肾脏纤维化模型,Blab/C小鼠通过结扎单侧输尿管建立肾脏纤维化模型。前者采集各组的血清检测肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)值；两组均根据Masson染色结果观察肾脏组织纤维化程度；用免疫组织化学染色观察CIP4在模型组和假手术组的表达和分布。Western blotting检测E-cadheri、occludin、 β-cateni、Par6和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth nuscke actin, α-SMA)蛋白表达变化。结果5/6肾切除模型中,手术组动物Scr, BUN水平高于假手术组；手术组Masson染色显示肾间质明显纤维化,部分肾小球硬化,肾小管萎缩,小管上皮细胞脱落,CIP4表达量上调,主要分布在肾小管上皮细胞侧基底膜细胞连接处。UUO模型中,手术组Masson染色显示肾间质有较多纤维组织形成,部分肾小管扩张,部分肾小管萎缩、上皮细胞脱落。CIP4表达也上调,主要分布在肾小管上皮细胞区域。两种动物模型westen blotting结果均显示,CIP4表达量增加(分别为假手术组的3.91倍和3.64倍)伴随着E-cadherin及occludin表达的下降,α-SMA表达增加(P<0.05),β-catenin和Par6表达量无明显变化。结论CIP4在纤维化的组织中表达明显增加,且主要分布于肾小管上皮细胞,提示CIP4与肾间质纤维化关系密切。第二部分TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化中CIP4的表达与分布目的探讨大鼠肾小管上皮细胞(Normal rat kidney52E, NRK52E细胞)在TGF-β1诱导下CIP4蛋白表达量的变化。方法NRK52E细胞在含有TGF-β1(10ng/ml)的培养液中培育72小时,光学电子显微镜观察细胞形态的变化；提取细胞蛋白,Western blotting检测CIP4、E-cadherin、 occludin、β-catenin、Par6以及α-SMA蛋白表达的变化。结果对照组细胞呈铺路石样外观,细胞间连接紧密,细胞形态规则；模型组细胞体积变大,形状不规则,细胞间连接松散,间隙变大。Western blotting结果显示与对照组相比,TGF-β1刺激组的NRK52E细胞CIP4表达上调,为对照组的1.72倍,同时α-SMA蛋白表达也增高,E-cadherin及occludin表达量减少(P<0.05),β-catenin和Par6表达量无统计学差异。结论体外实验与体内模型所得到的结果一致,提示CIP4参与TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化进程。第三部分CIP4对E-cadherin表达的影响与调节目的探讨在肾小管上皮细胞转分化的过程中,CIP4对P-catenin核转位的调控,以及对E-cadherin表达的影响。方法用脂质体2000将pcDNA4.0/CIP4质粒瞬时转染至NRK52E细胞内,Western blotting检测相关各蛋白的表达；免疫荧光法检测CIP4及β-catenin在细胞内的共定位,用共聚焦显微镜观察；免疫沉淀法检测CIP4与β-catenin的相互作用；用特异性siRNA敲除相关蛋白的表达。结果在TGF-β1刺激组中,CIP4和β-catenin在核蛋白中的表达均增加,分别为对照组的1.82倍和1.59倍。在共聚焦显微镜下观察,免疫荧光结果显示正常组CIP4与β-catenin主要分布于细胞膜,且在细胞膜上存在部分共定位,模型组中,CIP4与β-catenin在细胞膜上分布减少,细胞核内表达增多,细胞核内存在部分共定位现象；同时用免疫沉淀法检测,在这两组细胞中CIP4和β-catenin均存在着相互作用。在倒置显微镜下观察到,对照组细胞形态规则,呈铺路石样的外观,细胞间连接紧密；转染了CIP4质粒的细胞细胞形态不规则,连接松散,体积变大,其改变与TGF-β1刺激后的细胞相类似；而转染了pcDNA4.0空载体的细胞则未发生上述改变。单独转染CIP4目的基因质粒的NRK52E细胞中,CIP4与α-SMA表达上调,E-cadherin表达减少(P<0.05),β-catenin的表达无明显变化。用特异性的siRNA沉默CIP4的表达后,CIP4的表达量只为原来40%。随着CIP4表达的下降,E-cadherin表达升高,甚至高于对照组(P<0.05),同时β-catenin的表达仍无明显的变化。NRK52E细胞转染CIP4质粒后,核蛋白中CIP4与β-catenin表达均增加(P<0.05),特异性敲除CIP4后,CIP4在核蛋白中表达下降,β-catenin的表达也下调(P<0.05)。将β-catenin特异性siRNA转染至NRK52E细胞,β-catenin的表达量下降为对照组的65%,E-cadherin与CIP4表达量无明显改变,在已转染高表达CIP4质粒的细胞中再转染特异性的P-catenin siRNA,与对照组相比,只转染CIP4质粒组的细胞,E-cadherin表达随CIP4表达的增高而下降(P<0.05),而在既转染了CIP4质粒也转染了β-catenin siRNA的细胞中,E-cadherin的表达恢复至对照组水平(P<0.05)。结论CIP4可通过促进β-catenin入核,从而调节E-cadherin的表达。第四部分CIP4对occludin表达的影响目的探讨NRK52E细胞高表达CIP4后对紧密连接蛋白occludin表达的影响及与极性蛋白Par6之间的相互作用关系。方法用脂质体2000将pcDNA4.0/CIP4质粒瞬时转染至NRK52E细胞中,Western blotting检测相关各指标的变化；用免疫沉淀法检测CIP4与Par6之间的相互作用。结果单独高表达CIP4, occluidn表达下降,α-SMA蛋白表达量上升,Par6表达量无明显变化,与TGF-β1作用后相关蛋白改变一致。在TGF-β1刺激组与CIP4质粒转染组的细胞中,存在CIP4与Par6的相互作用。而在对照组细胞中则未观察到该现象。结论CIP4可能通过与Par6相互作用,参与occludin表达的调节。