NKG2D,凝集素样的2型跨膜蛋白,是一种由NK细胞、NK1.1+T细胞,γδ T细胞,CD8+T细胞和一些髓细胞表达的刺激性免疫受体。NKG2D识别多种不同的配体,这些配体与MHCⅠ类分子远系相关,包括人的MICA/B、ULBPs和小鼠的Rae1、Mult1以及H60。这些配体虽然不是组成型表达的,但可以由压力诱导表达,如病毒感染、细胞恶性转化或者DNA损伤。NKG2D配体的表达,使得靶细胞对NK细胞的杀伤更为敏感,并且能促进NK细胞分泌INF-γ。NKG2D活化NK细胞,在炎症的起始和维持中发挥了重要了作用。据报道,NKG2D活化参与了NK细胞介导的过敏性气道炎症,使用NKG2D阻断性抗体能够延缓气道过敏;而在肾缺血模型中,NKG2D与配体之间相互识别,会引起局部的炎症和白细胞的聚集；通过注射非清除性的NKG2D单克隆抗体,阻断NKG2D的信号通路,不仅对由于细胞转输引起的SCID小鼠的结肠炎有帮助,而且还能够减缓胶原诱导的关节炎。除此之外,近几年我们和其他研究组也都报道了,通过抗体阻断NKG2D与配体相互作用,能够减轻由NKG2D介导的乙型肝炎病毒感染群中所发生的急性肝炎。因此,阻断NKG2D与配体的识别将成为治疗各种组织局部炎症的潜在方法。NKG2D表达在淋巴细胞上,淋巴细胞的游走性增加了靶向NKG2D的难度,而NKG2D的配体分子多表达在驻留性的细胞上,包括肝脏实质细胞、Kupffer细胞、肿瘤细胞等等,所以,靶向NKG2D的配体比靶向NKG2D分子本身更易操作,且时效会更长。单克隆抗体的蛋白质本质使得它在体内容易发生降解,时效短,这使得它需要多次注射以达到效果并且因此造成太大的成本,因此在本研究中,我们选择了RNA干扰技术靶向NKG2D配体进行基因沉默。在NKG2D配体多样性的背景下,我们构建了多靶点RNA干扰质粒,通过一种单一载体表达多个分子shRNA,从而同时靶向NKG2D的多个不同配体。通过PCR扩增得到不同靶点分子(Rae1, Mult1, H60以及无关序列)的shRNA转录单位,包括H1启动子、shRNA表达框以及终止子,继而将不同的shRNA转录单位通过酶切和连接后串联到腺病毒的穿梭质粒pRNAT-H1.1/shuttle上。我们构建了一系列多靶点RNA干扰载体,包括三配体干扰载体及其对照载体,包括两配体干扰载体、单配体干扰载体,以及无关干扰载体。本论文中,我们选择polyⅠ:C&D-GalN联合注射引起的爆发性肝炎和刀豆蛋白ConA注射HBsAg-Tg小鼠诱发肝损伤模型,来研究该多靶点RNA干扰质粒的功能。分离小鼠肝内淋巴细胞,通过定量PCR和流式细胞术分别检测NKG2D各配体的mRNA、蛋白质水平；收集小鼠血清检测转氨酶水平、IFN-γ和TNF-a浓度、以及组织切片观察肝脏病理学变化；分离小鼠肝脏淋巴细胞数目、流式检测其表型以及细胞因子分泌,观察多靶点]RNA干扰质粒保护肝脏损伤的分子机制。我们还构建了针对人源NKG2D配体的多靶点RNA干扰质粒,并稳定转染人正常肝细胞系L-02,在与NKG细胞共同孵育后,通过51Cr释放检测NKG细胞杀伤活性,同时流式检测CD107a脱颗粒表达。通过上述研究方法取得结果如下：1. NKG2D配体多靶点RNA干扰载体的构建首先利用siRNA设计软件,根据数据库中的NKG2D配体(Rae1,Mult1和H60)的mRNA序列,选择这几种分子的小干扰RNA序列。通过将化学合成修饰的siRNA或者shRNA表达质粒体外转染到相应的阳性表达细胞,筛选得到干扰效率最高的小干扰RNA序列,用于下一步实验。通过PCR扩增得到不同靶点分子(Rae1, Mult1, H60以及无关序列)的shRNA转录单位,包括H1启动子、shRNA表达框和下游终止子,继而将不同的shRNA转录单位通过酶切和连接后串联到腺病毒穿梭载体pRNAT-H1.1/shuttle上。2. NKG2D(?)配体多靶点RNA干扰载体功能验证为了进一步验证以上构建的一系列NKG2D配体多靶点RNA干扰质粒的干扰效率,我们选择了polyⅠ:C联合D-GalN诱导小鼠急性肝脏损伤模型,这是依赖于NK细胞的由NKG2D介导的爆发性肝炎。联合注射18小时后分离小鼠肝脏实质细胞,通过流式检测,发现NKG2D多个不同配体在蛋白质水平表达都有所上调,这也暗示了了NK细胞可能通过NKG2D与其多个不同配体的相互作用被活化。而当我们将NKG2D配体多靶点RNA干扰质粒对小鼠进行高压注射时,发现小鼠肝脏实质细胞上NKG2D的三个配体能够被不同程度地抑制表达,包括mRNA水平和蛋白质水平。其中,pRNAT-shRMH能够同时抑制三种配体(Rae1、Mult1和H60)的表达,其对每个配体的抑制效率与相应的单配体和双配体RNA干扰质粒几乎一致：如pRNAT-shRMH对Rae1的沉默效率同pRNAT-shRNN、pRNAT-shRMN和pRNAT-shRNH几乎一致,这也证明了该多靶点RNA干扰质粒的干扰特异性。总结来说,三配体RNA干扰质粒pRNAT-shRMH同时干扰三个分子的表达,而单配体、双配体RNA干扰质粒只抑制其相应的配体的表达。3. NKG2D配体多靶点RNA干扰载体保护小鼠免受polyⅠ:C/D-GalN诱导的急性肝脏损伤polyⅠ:C/D-GalN联合注射会诱导小鼠发生爆发性肝脏损伤,这一过程中小鼠肝脏实质细胞表面NKG2D的三个不同配体都有不同程度的上调表达。那么NKG2D配体多靶点RNA干扰质粒能否通过高压注射下调肝实质细胞上NKG2D的配体表达,减少NKG2D与其配体的相互作用,达到减轻损伤的目的呢?我们在polyⅠ:C/D-GalN联合注射前3天对小鼠给予NKG2D配体多靶点RNA干扰质粒及对照质粒的高压注射,发现接受过NKG2D配体多靶点RNA干扰质粒预先处理的小鼠,其肝脏炎症有不同程度的减轻,包括血清转氨酶水平下降、血清中炎性因子IFN-γ、TNF-α浓度下降、肝脏组织切片病理程度减轻。而通过比较几种不同的单配体RNA干扰质粒的结果,我们发现pRNAT-shRNN(仅靶向Rael)的保护效果要明显高于pRNAT-shNMN(仅靶向Multl)和pRNAT-shNNH(仅靶向H60)这两种载体,说明Rae1配体在这三个配体中,发挥的作用相对更大。当在pRNAT-shRNN的基础上再多干扰一种配体分子,肝脏炎症能够被进一步抑制。更进一步的是,三个配体同时被RNA干扰的质粒pRNAT-shRMH能够最明显的减轻小鼠肝脏炎症。致死剂量polyⅠ:C/D-GalN处理后小鼠的存活率数据也支持这一结论,因为pRNAT-shRMH处理后,小鼠的存活率从0%提高到了100%。RNAi的实验结果与阻断性抗体几乎一致。实验结果显示,用NKG2D阻断性单克隆抗体对小鼠预先注射后,同样能够有效地减轻polyI:C/D-GalN联合注射诱导的急性损伤；而NKG2D配体的阻断性抗体虽然也能不同程度低减轻炎症(Rae1>Mult1>H60),但都不能达到NKG2D抗体的效果。而用这些配体的抗体的混合物,取同样剂量,对小鼠进行预先干预,又能够高效地保护小鼠因polyⅠ:C/D-GalN引起的急性肝脏损伤,暗示了NKG2D的不同配体均参与了NK细胞介导的NKG2D依赖的肝脏炎症。与阻断性抗体比起来,RNAi干扰载体在体内发挥作用的时间要更长,也更加稳定。我们分离小鼠肝脏淋巴细胞,计数并检测其表型,发现不同质粒处理组的小鼠淋巴细胞总数及比例都没有统计学差异,并且NK细胞表面NKG2D表达也没有变化。而pRNAT-shRMH处理组NK细胞分泌IFN-γ明显低于对照载体pRNAT-shNNN处理组,这表明,NKG2D配体多靶点RNA干扰质粒通过阻断NKG2D与配体的相互作用,抑制了NK细胞的活化。4. NKG2D配体多靶点RNA干扰重组腺病毒的构建及应用由于NKG2D配体多靶点RNA干扰质粒都是通过高压注射的方式进入体内进行干预,为了改善多靶点RNA干扰的给药手段,我们将NKG2D多配体shRNA表达框进一步重组到腺病毒载体上,包装成可应用于临床治疗的重组腺病毒,因为腺病毒具有嗜肝性并且感染效率更高。三配体RNA干扰质粒pRNAT-shRMH和无义对照质粒pRNAT-shNNN被进一步改造成携带相应shRNA表达框的重组腺病毒。我们发现,重组腺病毒Adeno-shRMH能够通过常规的尾静脉注射方式,达到与质粒高压注射相同的肝炎保护效果。而且,重组腺病毒的保护作用可以持续10天,因为提前10天注射重组腺病毒Adeno-shRMH,仍然可以减轻polyⅠ:C/D-GalN引起的爆发性肝脏损伤。5. NKG2D配体多靶点RNA干扰载体保护HBsAg-Tg小鼠免受ConA诱导的急性肝脏损伤除了polyⅠ:C/D-GalN急性损伤模型,我们想知道该载体是否在其他模型中同样起作用。接下来,我们选择了ConA刺激HBsAg-Tg小鼠,因为HBsAg-Tg小鼠在ConA刺激后会诱发急性肝脏损伤,并且这是依赖于NKG2D与配体(Rael和Multl)相互作用的。同样,我们提前3天给HBsAg-Tg小鼠用NKG2D配体多靶点RNA干扰载体进行预先高压注射,然后再用ConA进行刺激,18小时后,收集小鼠血清检测转氨酶变化以及肝脏组织病理变化。我们非常惊喜的发现,NKG2D配体多靶点RNA干扰质粒(pRNAT-shRMH和(?)pRNAT-shRMN)预先处理小鼠后,同样能够有效减轻ConA引起的肝脏炎症。这进一步证实了此多靶点RNA干扰质粒对多种不同的NKG2D介导的炎症具有广泛的保护作用。6.人源NKG2D(?)配体多靶点RNA干扰质粒的构建及其应用为了紧密联系临床实际,我们进一步针对人源NKG2D配体(MICA/B、 ULBP2、ULBP3)构建了一系列多靶点RNA干扰质粒,包括三配体干扰质粒、单配体干扰质粒等。为验证这些质粒的功能,我们选择了人正常肝细胞系(L-02),因为L-02细胞在正常情况下高表达NKG2D的多种配体,包括MICA/B, ULBP2和ULBP3。将人源NKG2D配体多靶点RNA干扰质粒转染L-02细胞,筛选得到稳定转染的低表达细胞系,流式细胞术检测发现,稳转低表达细胞表面NKG2D三个配体都有不同程度的下调。51Cr细胞毒性实验证明,稳转的低表达细胞系与NKG细胞共同孵育后,NKG细胞的杀伤毒性明显降低,并且流式结果也发现NKG表达CD107a水平也显著降低。以上结果进一步证明了多靶点RNA干扰质粒可以通过下调肝细胞表面NKG2D的配体表达,从而减少人肝脏的免疫损伤。