巴戟天为我国著名的“四大南药”之一,收载于《中国药典》2005年版(一部),来源为茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How的根,具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效,临床用于治疗阳痿遗精、宫冷不孕、月经不调、少腹冷痛、风湿痹痛、筋骨痿软等症。巴戟天在广东、福建、广西及海南均有自然分布,但目前野生资源产量稀少。广东历来做为巴戟天的历史道地产区,市场上销售巴戟天大部分产自广东。随着巴戟天开发利用的不断扩展,市场需求量激增,致使野生资源遭受毁灭性的破坏。由于野生巴戟天自我更新困难,为了巴戟天进一步的开发利用及种质资源保护,有必要对目前巴戟天的药用植物资源进行详细调查。同时对巴戟天道地性进行研究,可以为巴戟天规范化种植标准提供更多数据,促进巴戟天GAP(中药材生产质量管理规范)的建立,从而保证巴戟天的产量及质量,更好的保护巴戟天的种质资源。本文的主要研究内容如下:1文献研究查阅了大量的有关巴戟天及道地性研究的文献资料,对巴戟天的本草考证、资源分布、化学成分、药理作用、生态因子对道地性的影响及在道地性形成的分子机制等方面的研究及进展情况进行了总结。2实验研究2.1巴戟天的资源调查对广东、福建、广西及海南的巴戟天进行了生物学特性、野生与栽培资源及市场销售和加工情况多方面的调查,并收集了大量的巴戟天样品。在实地调查中发现目前在四省份均还有野生资源分布,但由于盲目采挖现象严重,野生资源遭到极大破坏,产量极低,野生巴戟天多生长在人迹罕至的原始林中,且多为单株或数株生长无成片分布。野生资源产量低主要是由于野生转家种及市场价格高,同时由于巴戟天自我更新困难使得巴戟天野生资源濒临灭绝。由于多种原因,目前只有广东还有大量栽培巴戟天,面积约有6万亩左右,且以德庆县面积最大,福建亦有少量栽培,而在广西、海南未有栽培。栽培巴戟天多生长在向阳面的坡地上,由于巴戟天的生物学习性旁多有小乔木或矮灌木遮荫,由于巴戟天生长年限长及采挖时易造成水土流失目前栽培面积有所缩小。巴戟天深加工品种较少,主要以药材形式销售且价格波动较大。由于巴戟天疗效显著,出口量年年递增,但重金属含量是制约巴戟天出口的主要因素。巴戟天有特定的生态要求。由于生长环境的不同在形态上有较大的差别,野生与栽培品间差异较明显:野生巴戟天叶型变异大,大叶与小叶均有,茎枝柔软且长呈缠绕状攀附高大植物生长,根部连珠状明显,断面多为淡紫色;栽培巴戟天有大叶型与小叶型两种,叶形多为长椭圆形,地上茎枝直立生长,分枝多,根部连珠状不明显肉质肥厚,断面白色。2.2生态因子对巴戟天药材道地性形成的影响研究对不同产区地理因子、气象因子的比较可以看出巴戟天的生长具有较强的地域性,对于地理因子及气象因子均有特定的要求。表明地理因子、气象因子对巴戟天道地性形成有较大的影响。18°40N～24°55N,107°17′E～117°15′E之间,海拔60m～650m年均温在19～25℃,年日照时数在1550～2000h,年均降水量在1200～2600mm之间,而相对湿度在80%左右的环境下的坡地最为适宜巴戟天的生长。对巴戟天生长因子中的土壤因子进行研究,发现巴戟天多生长在弱酸性的红壤或黄壤中,土壤质地不是影响其生长的主要因素。同时对与土壤的理化性质及微量元素对巴戟天质量的影响进行研究,通过相关分析及通径分析对土壤中的土壤质地、理化性质、微量元素分析,发现理化性质对巴戟天质量影响较大,其中对水晶兰苷含量影响最大的为土壤的pH,相关系数为-0.896,其他理化性质对于巴戟天质量均有一定得影响。同时由于速效磷与水晶兰苷也有极显著正相关,且其对水晶兰苷的间接作用最大,表明在巴戟天种植中可以通过实施磷肥影响土壤中其他成分的含量以提高其质量。对土壤中所含矿质元素对巴戟天中微量元素影响的研究,发现巴戟天中铁、锰含量明显高于其他微量元素,且植株中锰含量大大多于土壤中锰的含量,平均富集系数达到3.58,说明巴戟天对微量元素有选择性吸收,对土壤中铁、锰吸收较多且对锰有特别的富集作用,这与巴戟天补肾壮阳作用相符合。巴戟天对铅的富集呈正相关关系,相关系数为0.964,这可能是造成植株中铅含量超标的原因之一。生态因子对巴戟天质量及道地性的形成有较大的影响,通过调节各生态因子可以提高巴戟天的质量,为巴戟天规范化种植提供实验依据。三、基于序列分析探讨巴戟天道地药材形成的内在原因目前主要应用于分子鉴别的RAPD、ISSR都具有快速、简便,多态性高等特点但是重复性差,而碱基序列不仅具有快速、准确性高的特点而且重复性高、稳定,故本研究选取巴戟天核基因组内转录间隔区ITS序列(Internal transcribed spacer),叶绿体基因组matK(maturase K)、非编码区trnL-F序列进行PCR直接测序,并进行群体遗传研究。结果表明巴戟天ITS序列可用于研究巴戟天道地性药材形成的分子机制,可以较好的区分广西及海南的巴戟天居群,同时群体遗传结果分析结果表明了同一省份间巴戟天样品遗传分化程度低、基因交流多、遗传差异小;而四省份间广东与福建样品遗传距离最小,分化少,遗传差异小,而海南及广西与其余省份的遗传距离均较远、分化程度高、遗传变异大。ITS全长为567bp,包括ITS1、5.8s、ITS2,ITS1和ITS2区变异位点共20个,信息位点9个,共17个单倍型。而对单倍型分析可以得到广东巴戟天可能为巴戟天的祖先群,与广东作为道地产区的地位相一致。同时由碱基变异不能将广东与福建南靖的巴戟天区分开,暗示福建南靖亦可看为道地产区;同时对巴戟天的群体遗传结构的分析结果可以看出,广西及海南的巴戟天样品与广东、福建等地的样品遗传距离较远,分化程度高这与聚类分析结果相一致。在整个遗传变异中群体外变异的贡献大于群体内,说明ITS序列可作为居群间区别的分子标记。对巴戟天群体间的地理距离与基因流的相关性进行检验,结果显示基因流与地理距离呈正相关关系,地理距离较近的居群间基因流水平高。对trnL-F、matK序列进行分析得出这两个序列碱基变异小,不能做为巴戟天不同产地不同居群间区分的特征序列。其中trnL-F序列包括trnL内含子及trnL-F非编码区(trnL intron and trnL—F intergenic spacer)长923～936bp,6个单倍型,其中748～760bp的13个位点的碱基缺失为海南独有,可作为区别点。matK序列长1135～1144bp,变异位点13个,7个单倍型,由于没有稳定的碱基变异故不能作为特征分子标志。由于对于巴戟天的研究主要集中在化学成分及药理作用方面,而未有对巴戟天道地性的系统研究,本研究对巴戟天道地性形成中生态因子、分子机制进行研究结果表明生态因子、分子机制是影响巴戟天道地性的重要因素。