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丹参(Salvia m iltiorrhiza)作为我国的传统中药,为唇形科(Labiatae)鼠尾草属,以根和根茎入药。现代化学及药理学研究表明丹参中丹参酮类和酚酸类化合物对于治疗心脑血管疾病具有显著疗效。作为重要的药用植物,其体内的其他挥发性萜类的研究较少,萜类的生物合成途径需要更多的研究来解析和发现。本研究中采用RACE技术从丹参中克隆得到4条倍半萜合成酶基因YL-I、YL-4、YL-5和YL-6,于大肠杆菌中表达,进行体外酶活性鉴定,之后将蛋白纯化测定酶动力学参数。并且通过real-time PCR分析四条基因的组织特异性表达及外源激素对基因表达的影响。主要结果如下：1.获得了4条倍半萜合成酶基因YL-I, YL-4, YL-5和YL-6的基因全长。其中YL-1基因核苷酸序列长1629bp,编码542个氨基酸残基；YL-4基因核苷酸序列长1641bp,编码546个氨基酸残基；YL-5基因核苷酸序列长1641bp,编码546个氨基酸残基；YL-6基因核苷酸序列长1641bp,编码546个氨基酸残基；Blast比对显示,分离的序列与已鉴定的倍半萜合酶基因具有很高的同源性。2.将4条基因分别插入原核表达载体pET28a构建重组质粒,在大肠杆菌中进行表达,经SDS-PAGE分析后得到重组蛋白进行酶活鉴定,发现以FPP为底物时,YL-1催化得到的产物分别是α-香柑油烯(a-bergamotene), a-檀香烯(a-santalene), (E)-p-金合欢烯((E)-β-famesene)和p-倍半水芹烯(β-Sesquiphellandrene),而YL-4、YL-5和YL-6编码的三个蛋白催化产物则是单一的,只得到瓦伦烯。利用纯化蛋白测定酶动力学参数,结果显示YL-1的米氏常数Km值为16.47μM, 其相应的kcat值为0.2268min-1。 YL-4, YL-5和YL-6的Km值分别为73.34μM,21.53μM口17.39 μM,对应的kcat值为297.7 min-1,128.8 min-1和111.9 min-1。3.以Actin基因作为内参,利用real-time PCR技术对四条基因在丹参不同部位的表达水平进行分析。YL-1在各组织的表达量从大到小依次是根>叶>花>茎；YL-4在各组织的表达量从大到小依次是叶>花>根>茎；YL-5在各组织的表达量从大到小依次是叶>花>根>茎；YL-6在各组织的表达量从大到小依次是花>叶>根>茎。施加外源激素4h后,提取丹参地上部分,通过real-time PCR分析4条基因表达量的变化。其中,乙烯和脱落酸对4条基因的表达量均表现为正调控作用。SA则使YL-1、YL-4、YL-5和YL-6的相对表达量下调且效果明显。