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研究目的作为新型替代产品而常用的有机磷阻燃剂(Organic phosphorus flame retardants,OPFRs),磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate,TDCIPP)已成为一种环境污染物,在大气、水体及室内等环境中均有检出。研究表明,TDCIPP暴露具有许多毒性作用,如抑制神经发育,影响生殖系统和干扰内分泌等,人群流行病学调查结果显示,OPFRs的早期暴露对儿童和青少年神经系统的发育有严重的损害作用,但是其损伤机制尚未阐明。CircRNA是一种环状非编码RNA,能够参与多种细胞通路的基因表达调控,目前已发现在个体发育、疾病发生、神经系统发育过程中起到重要作用。然而circRNA是否在TDCIPP暴露引起的细胞毒性效应中发挥作用及机制还并不清楚。因此本研究探讨circRNA在TDCIPP暴露引起的大鼠PC12细胞炎症效应及凋亡作用中的调控机制,探究TDCIPP暴露导致PC12细胞炎症因子表达变化、发生凋亡的原因,从而对TDCIPP的毒性机制有进一步的了解。研究方法一、TDCIPP暴露所致PC12细胞炎症损伤的关键circRNA调控机制研究:使用神经生长因子(nerve growth factor,NGF)诱导未分化的大鼠PC12细胞进行分化处理3天后,分别以0,15,30,60μmol/L浓度的TDCIPP暴露处理细胞72h,通过ELISA实验对炎症因子(IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6)进行表达水平检测;然后利用circRNA微阵列芯片对TDCIPP暴露组和对照组进行筛查,并选取5个与炎症效应相关性较高的circRNA进行qRT-PCR验证,通过Target Scan和miRanda预测与circRNA相互作用的基因和miRNA,对与circRNA互作的基因进行GO分类分析和KEGG通路富集分析;使用Cytoscape软件对选取的5个circRNA相互作用的基因和miRNA进行互作网络分析。并通过western blot和qRT-PCR技术进行表达验证,进一步通过荧光素酶报告基因鉴定相关基因与miRNA的结合情况。二、TDCIPP暴露所致PC12细胞凋亡损伤的关键circRNA调控机制研究:未分化的大鼠PC12细胞加入神经生长因子(NGF)诱导分化处理3天后,分别以0,15,30,60μmol/L浓度的TDCIPP暴露处理细胞72h,使用Hoechst33342染色及通过流式细胞仪对细胞进行凋亡检测,对凋亡重要通路PI3K/Akt信号通路中Ddit4及其关键基因的表达水平通过western blot和qRT-PCR检测。转染sh RNA-Ddit4病毒载体后通过western定量关键蛋白(Ddit4、Beclin1、LC3)的表达并进行对比;然后对转染的PC12细胞TDCIPP暴露后进行circRNA微阵列筛查,Target Scan和miRanda预测后选取与Ddit4相关性高的circRNA、miRNA进行qRT-PCR定量,并使用Cytoscape软件将相关基因和miRNA进行互作网络分析。并通过双荧光素酶报告基因检测Ddit4与相关miRNA的结合情况。研究结果1.TDCIPP暴露所致PC12细胞炎症损伤的关键circRNA调控机制研究1.1 TDCIPP暴露72h后PC12细胞中相关炎症因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6浓度均明显升高。1.2 TDCIPP暴露PC12细胞72h后使细胞内circRNA表达发生明显改变(1682个circRNA表达上调,1750个circRNA表达下降,倍数变化≥1.5,p≤0.05),其中rno＿circRNA＿003733、rno＿circRNA＿017350过表达,而rno＿circRNA＿001505、rno＿circRNA＿013845、rno＿circRNA＿003717表达量降低,KEGG分析显示这些circRNA参与调节MAPK通路、TNF通路、NF-κB通路等多条信号通路。其中对rno＿circRNA＿013845通过Target Scan和miRanda预测显示其与Traf2存在互作情况。1.3对Traf2和rno＿circRNA＿013845相关miRNA的表达水平检测后发现在TDCIPP暴露组表达明显升高,其中对rno-miR-361-3p与rno-miR-702-3p分析表明与Traf2存在结合位点。双荧光素酶报告基因显示Traf2与rno-miR-702-3p在细胞内确实存在结合现象。1.4 qRT-PCR和western blot检测结果显示TDCIPP暴露可诱导PC12细胞内Traf2m RNA和蛋白表达水平的明显升高。同时NF-κB通路下游关键基因Ripk1、Ikbkg、Bric3表达水平同样明显升高。2.TDCIPP暴露所致PC12细胞凋亡损伤的关键circRNA调控机制研究2.1 TDCIPP暴露使PC12细胞出现凋亡现象,且凋亡水平随TDCIPP浓度升高而增加。2.2 TDCIPP暴露使PC12细胞内Ddit4、Beclin1、LC3等凋亡和自噬相关蛋白表达水平明显升高。sh RNA-Ddit4病毒载体转染PC12细胞TDCIPP暴露后能够降低Ddit4、Beclin1、LC3蛋白表达。2.3 TDCIPP暴露使Ddit4相关的mmu＿circRNA＿20236表达量明显升高和rno-miR-3573-5p表达水平显著降低。sh RNA-Ddit4病毒载体转染PC12细胞TDCIPP暴露后circRNA表达水平与对照组相比差异变化为30个circRNA表达明显上调,4个circRNA表达明显下降。2.4双荧光素酶报告基因显示rno-miR-3573-5p与Ddit4在细胞内能够结合。结论1、TDCIPP暴露所致PC12细胞炎症损伤的关键circRNA调控机制研究:1.1 TDCIPP暴露能够导致PC12细胞出现炎症反应。1.2 rno＿circRNA＿013845可能在PC12细胞内发挥rno-miR-702-3p海绵的作用,抑制Traf2的表达,同时rno-miR-702-3p与Traf2存在结合位点,在体内可能对Traf2的表达起正向调节作用。1.3在TDCIPP暴露后的PC12细胞中rno＿circRNA＿013845—rno-miR-702-3p—Traf2可能是调控炎症反应的通路,并通过调控NF-κB下游因子而导致炎症效应。2、TDCIPP暴露所致PC12细胞凋亡损伤的关键circRNA调控机制研究:2.1 TDCIPP暴露能够导致PC12细胞出现凋亡和自噬现象。2.2 Ddit4在TDCIPP致PC12细胞凋亡和自噬效应过程中可能发挥重要作用。2.3在TDCIPP暴露后的PC12细胞中mmu＿circRNA＿20236—rno-miR-3573-5p—Ddit4可能是调控细胞凋亡效应的通路,并可能通过调控PI3K/Akt—mTOR信号通路来介导凋亡损伤效应。