多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种中枢神经系统(CNS)慢性炎症性脱髓鞘疾病;其特征性病理改变是CNS白质内多发性脱髓鞘斑块。确切病因及发病机制尚不清楚,目前普遍认为MS是主要由CD4+T细胞介导的自身免疫反应性疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)与MS在临床表现和病理过程十分相似,被认为是研究MS的发病机制和治疗方法的理想动物模型。　　 Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是1991年在研究果蝇胚胎发育时发现的一种跨膜蛋白。1997年Janewayt等首次在人体分离出了Toll样受体同系物,后将其命名为TLR4。目前为止,已经已确认人类11个TLRs家族成员和鼠类13个成员,TLRs主要分布于免疫细胞如树突状细胞、淋巴细胞、单核巨噬细胞等,在白细胞、内皮细胞、心肌细胞等也有不同程度的表达。TLR家族成员均属I类跨膜蛋白,由胞外区、跨膜区和胞质区组成。不同的TLR可相对特异地识别不同的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)。其中,TLR4是主要的脂多糖(LPS)识别受体,同时,脂磷壁酸、纤粘连蛋白、紫杉醇等也可作为TLR4的配体。由LPS诱导的TLR的活化不仅可以通过激活核因子KappaB(NF-κB)而最终诱导免疫细胞释放炎症因子如TNF-α等,还可以诱导树突状细胞成熟分化以及产生各种细胞因子激活B细胞,从而对获得性免疫的建立起着很重要的作用。　　 过氧化体增殖物激活型受体(Peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)是一组核激素受体,PPAR在体内主要有3种亚型,即α,β和γ型。PPARs激动剂具有多种生物效应,改善脂代谢紊乱,增强机体胰岛素敏感性,影响肿瘤生长,对心血管产生保护效应。新近研究表明,活化的PPARs亦能发挥抗炎和神经保护作用。目前认为PPARα激动剂对自身免疫性神经退行性疾病的神经保护作用有以下机制参与:(1)上调保护性Th2细胞比例,发挥神经保护作用。(2)减少Th1细胞及其细胞因子的产生,降低其致脑脊髓炎损伤作用。(3)通过T细胞受体抑制炎性细胞的分泌增加。(4)趋化因子MCP-1等的分泌,抑制炎症反应。(5)维甲酸类X受体(RXRs)与PPARpα相互作用后,形成异二聚体,上调PPAR基因表达。(6)抑制巨噬细胞和小胶质细胞分泌的NO。由此可见,PPARα激动剂有望成为治疗CNS疾病的新靶点。　　 本实验通过观察PPARα激动剂非诺贝特对脂多糖作用下人淋巴瘤T细胞TLR4信号传导通路相关因子表达的影响。从而探讨PPARα激动剂非诺贝特能否通过抑制TLR4表达起到抑制炎症扩大的作用。　　 实验材料与方法：　　 1、实验用细胞及细胞培养　　 人淋巴瘤T细胞HuT102(购买于武汉大学中国典型培养物保藏中心CCTCC编号:GDC051)用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液,置于37℃、5%CO2孵箱中培养,培养液中加青霉素和链霉素各100μg/ml,2-3天更换培养基并传代一次。　　 2、脂多糖对人淋巴瘤T细胞(HuT102)TLR4信号传导通路中相关因子的影响。　　 (1)用RT-PCR方法检测不同浓度LPS(空白对照组、0.01μg/ml,0.1μg/ml,1μg/ml)刺激Hut102细胞后TLR4、IRAK-1、TNF-αmRNA表达。　　 (2)用RT-PCR方法检测不同时间LPS(0,2h,4h,6h)刺激Hut102细胞后TLR4、IRAK-1、TNF-αmRNA表达。　　 (3)用ELISA方法检测不同浓度LPS(空白对照组、0.01μg/ml,0.1μg/ml,1μg/ml)刺激Hut102细胞后TNF-α蛋白的表达。　　 3、非诺贝特对脂多糖作用下人淋巴瘤T细胞(HUT102)TLR4信号传导通路中相关因子的影响。　　 (1)用RT-PCR方法检测不同浓度非诺贝特(0.1%DMSO、100μmol/L、50μmol/L)对脂多糖(1μg/ml)作用下HUT102细胞TLR4、IRAK-1、TNF-α mRNA表达。(2)用ELISA方法检测不同浓度非诺贝特(0.1%DMSO、100μmol/L、50μmol/L)对脂多糖(1μg/ml)作用下HuT102细胞上清TNF-α蛋白的表达。　　 结果：　　 1、不同浓度LPS刺激Hut102细胞后TLR4、IRAK-1、TNF-αmRNA表达。　　 与对照组相比,经不同浓度LPS刺激4h后,上述目的基因mRNA表达均升高。以1μg/ml浓度组的上调作用最明显(p＜0.01)。　　 2、不同时间LPS刺激Hut102细胞后TLR4、IRAK-1、TNF-αmRNA表达。　　 与对照组相比,经1μg/mlLPS刺激不同时间(2、4、6h)后,上述目的基因mRNA表达均升高。以刺激6hr组的上调作用最明显(p＜0.01)。　　 3、不同浓度LPS刺激Hut102细胞后TNF-α蛋白的表达。　　 不加LPS刺激的对照组中TNF-α蛋白的表达量为521.47pg/ml,经不同浓度的LPS刺激12hr后,TNF-α蛋白的表达量分别为703.87pg/ml、1028.03pg/ml、1636.08pg/ml(p＜0.01)。　　 4、非诺贝特对LPS刺激Hut102细胞后TLR4、IRAK-1、TNF-α mRNA表达的影响　　 与0.1%DMSO对照组比较,不同浓度的非诺贝特(100μmol/L、50μmol/L)组TLR4、IRAK-1、TNF-αmRNA均下调(p＜0.01)。　　 5、非诺贝特对LPS刺激Hut102细胞TNF-α蛋白表达的影响　　 与0.1%DMSO对照组比较,不同浓度的非诺贝特(100μmol/L、50μmol/L)组TNF-α蛋白下调。其中,100μmol/L非诺贝特抑制率为57.14%,50μmol/L非诺贝特抑制率为40.60%。　　 结论：　　 Hut102细胞在自然状态下存在TLR4信号传导通路;　　 LPS可上调体外培养HuT102的TLR4信号传导通路相关因子表达,并呈时间和剂量依赖关系;　　 非诺贝特可拮抗LPS对TLR4通路相关因子表达上调作用。