牙周炎是一类严重危害人类口腔健康的慢性感染性疾病,在全球有着极高的发病率,是导致成人牙齿松动直至缺失的首要原因,而近年来的研究表明缺氧环境能加重牙周炎病变过程,影响牙周组织的防御与修复。尽管当前缺氧对牙周炎作用的研究取得一定进展,但具体机制尚不明确。牙周炎的生物学基础是牙周组织介导的骨形成和骨吸收失衡,伴随着牙周组织的的直接破坏和免疫损伤,最终导致牙槽骨的丧失。目前研究认为,除了病原体的直接损伤外,牙周炎的病理损伤主要由病原体诱导牙周组织细胞分泌趋化因子、粘附分子、炎症因子,异常增高的炎性介质介导免疫细胞黏附移行聚集到炎症部位,并诱导破骨细胞(Osteoclasts,OC)前体细胞如外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs)向OC分化,从而造成牙周组织的破坏、降解和吸收。人牙周膜作为牙周组织的一个重要组成成分,主要由人牙周膜成纤维细胞(Human Periodontal Ligament Fibroblasts,h PDLF)所组成。hPDLF不仅参与了牙周组织的改建和再生,同时还具有一定的免疫调节能力,能与免疫细胞、内皮细胞等相互作用。因此,h PDLF的生物学活性与牙周炎的发生发展密切相关。但是,目前关于h PDLF在牙周炎病程中的调节作用,以及缺氧能否通过影响h PDLF的多种生物学特性,进而加重牙周炎疾病过程仍然很不清楚。在本研究中,我们首先观察h PDLF对不同细菌LPS产生的免疫应答,从而明确其在牙周组织免疫调节中的作用;其次我们观察在常氧和缺氧环境下,h PDLF内毒素耐受(Endotoxin Tolerance,ET)能力的变化,通过上述结果我们期望证实,在牙周炎早期,缺氧通过破坏hPDLF的ET,促进炎症因子分泌,从而加重免疫损伤;然后,我们将h PDLF与PBMCs进行共培养,观察在缺氧和常氧条件下,二者相互作用对炎症因子分泌的影响,从而说明缺氧可以通过增强h PDLF与PBMCs的协同作用,进一步增强炎症因子的分泌;最后,我们观察两种细胞在共培养条件下,缺氧能否影响hPDLF向成骨分化的能力,以及PBMCs向破骨分化的能力,并对缺氧调节细胞分化的机制进行初步探讨,以期证明,牙周炎发生时在h PDLF与PBMCs相互作用过程中,缺氧能通过影响两种细胞分化的能力,加重缺氧环境下牙周炎的病理损伤。在本研究中,主要分三个部分:第一,我们构建本课题所需要的实验平台,包括体外分离培养hpdlf和pbmcs及其鉴定;第二,我们在体外常氧和缺氧环境下分别构建hpdlf的et模型,对其分泌的细胞因子和表达的tlrs进行检测;第三,构建hpdlf和pbmcs共培养体系,观察缺氧环境是否影响二者炎症因子的分泌。同时,对两种细胞分化能力进行检测,并通过正反向实验初步探讨其分化能力改变的分子机制。我们希望通过我们的研究,更好地认识缺氧在促进牙周炎病理损伤中的作用。一、hpdlf和pbmcs的分离培养及鉴定1.hpdlf的分离培养及鉴定:沿冠根单向刮下根中1/3的牙周膜组织,0.1%i型胶原酶消化后进行组织块培养;细胞约10-14d可见大量透明纤维条索样细胞从组织块中爬出,细胞呈长梭形,免疫组化鉴定结果:小鼠抗人vimentin阳性,小鼠抗人cytokeratin阴性,表明hpdlf的间叶源性,而非上皮来源,结合取材部位、细胞形态学特征和组织来源可以证明我们分离培养的细胞即为hpdlf。2.pbmcs的分离培养及鉴定:采用ficoll-hypaque梯度密度离心法分离外周血细胞,经低速离心后细胞分4层,其中第2层为环状乳白色单个核细胞,即为pbmcs,giemsa染色对pbmcs分离纯度进行检测。二、缺氧条件下,hpdlf的et能力降低1.常氧条件下,hpdlf的et模型构建:分两次加入pglps或者eclps刺激hpdlf,其中初次加入两种细菌lps的剂量范围从0ng/ml-1000ng/ml,而再次加入两种lps的剂量为1000ng/ml。对细胞培养上清炎症因子浓度检测发现:第一,两种细菌lps初次刺激可以诱导6种炎症因子(il-8、il-6、il-1β、tnf-α、il-10以及il-12p70)表达上调,其中以il-8和il-6水平增加最为显著;第二,两种细菌lps再次刺激后,il-8和il-6浓度显著下降,提示两种lps均可以诱导hpdlf产生et。同时,我们对hpdlf在接受lps刺激后,其tlr2和tlr4在mrna和蛋白水平的表达进行了检测,发现hpdlf产生et后,tlr2和tlr4表达均下调,这说明两种lps再次刺激时可以通过hpdlf表达的tlr2和tlr4下调,诱导细胞产生et。2.缺氧条件下,hpdlfet能力的变化:利用常氧条件下建立的hpdlfet平台,我们对缺氧条件下,两种细菌lps诱导hpdlf炎症因子的分泌进行了检测。结果发现,与常氧条件不同的是,虽然缺氧条件下,两种lps初次刺激均可以诱导il-6和il-8浓度上调,但是再次刺激后,细胞并未出现et现象。同时,对再次刺激时hpdlf表达的tlr2和tlr4进行检测后发现,与初次刺激相比,两种lps再次刺激后,两种tlr表达量并没有变化。这说明缺氧可以破坏hpdlf的et,保持细胞对外界病原刺激物的持续反应性,从而维持炎症因子的高水平分泌。三、缺氧条件下,hpdlf与pbmcs共培养时炎症因子分泌,以及分化能力检测1.共培养时,细胞培养上清炎症因子浓度检测:hpdlf与pbmcs共培养24h后,收集上清进行炎症因子检测。结果发现,在常氧和缺氧共培养条件下,除了il-12p70没有检测到分泌外,其它5种炎症因子(il-8、il-6、il-1β、tnf-α以及il-10)浓度均明显上升。其中il-8、il-6以及il-12p70常氧和缺氧条件下表达基本一致,tnf-α表达缺氧强于常氧,而il-1β和il-10表达常氧高于缺氧,这说明氧浓度能够对两种细胞分泌炎症因子的种类和浓度进行调节。与pbmcs单独培养相比,在缺氧和常氧培养条件下,tnf-α无论是两种细胞间接共培养或直接共培养,其炎症因子分泌均呈下降趋势,其中缺氧条件下降低更为显著,其它细胞因子的变化则没有统计学差异。缺氧共培养是否依赖其它种类的炎性介质增强免疫损伤,尚需进一步研究证实。2.两种细胞共培养条件下,hpdlf向ob分化以及pbmcs向oc分化能力检测:通过alp和trap染色,分别观察hpdlf与pbmcs共培养条件下,两种细胞分化能力的变化。结果发现,缺氧、共培养时hpdlf向ob分化的能力减弱,而pbmcs向oc分化能力增强,单一培养的pbmcs没有形成典型的oc,这说明oc的形成需要两种细胞的相互作用,牙周炎发生时在pbmcs与hpdlf相互作用过程中,缺氧可以通过抑制hpdlf向ob分化,促进pbmcs向oc分化,从而增强牙周组织病理损伤。3.缺氧影响两种细胞分化的机制探讨:我们首先检测了hpdlf中转录因子hif-1α和nf-κb的表达,发现在缺氧3h时hpdlf中hif-1α蛋白表达上调,进一步通过抑制或增强hif-1α的表达,我们初步探讨了hif-1α在调节两种细胞分化中的作用。结果发现,yc-1抑制hif-1α表达后,hpdlf向ob分化受到抑制,而pbmc向oc分化能力增强,而在hpdlf中过表达hif-α则促进其向ob分化。这说明缺氧时hif-1α的表达起保护性作用,缺氧在调节hpdlf与pbmcs分化过程中,并不是以hif-1α依赖的方式促进破骨分化,缺氧促进破骨分化加重牙周组织损伤的调节机制还需进一步深入的研究。本研究成功分离培养hpdlf和pbmcs,并对二者进行了鉴定;我们发现lps能够调节hpdlf中tlr2和tlr4的表达,诱导自身et的产生,而缺氧则可以破坏et。这提示在缺氧影响牙周炎病变的过程中,外源性病原刺激物可能直接作用于et减弱或缺失的hpdlf,从而增强炎症因子分泌,加重牙周组织免疫损伤。随后我们对hpdlf与PBMCs在缺氧条件下的相互作用进行了探讨,发现hPDLF向OB分化能力减弱,而PBMCs向OC分化能力增强。进一步研究发现,缺氧时虽然h PDLF的HIF-1α表达上调,但并不参与这一调控过程。本研究首次证实了LPS能诱导hPDLF产生ET,并在一定程度上揭示了缺氧增强牙周炎损伤的机制,并进一步认识hPDLF的生物学特性,同时为各种病理刺激下,干预牙周炎疾病的进展提供了新的理论基础。