NM-3联合紫杉醇抗SCID裸鼠内原位移植人胃癌的分子作用机理

来源 :上海交通大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:dragoenix
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目的:建立SCID裸鼠内原位移植人胃癌模型,观察血管生成抑制剂NM-3对胃癌生长和转移的影响、对胃癌微血管形成和细胞凋亡的作用及其对血管生成因子VEGF、bFGF和TGF-β1等表达的影响;并观察NM-3与新的纯植物提取药物紫杉醇是否有协同作用,探讨NM-3联合紫杉醇治疗SCID裸鼠内原位移植人胃癌的分子作用机制,为以后治疗胃癌提供新的理论和实验依据。方法:选择中分化人胃癌细胞SGC 7901,采用组织块移植法,在SCID小鼠内建立原位移植人胃癌模型,24只小鼠随机分为四组:对照组(生理盐水对照,C组)、NM-3组(10mg/kg i.p. qod共8周,N组)、紫杉醇组(5mg/kg i.p. 3周、休息1周为1个疗程,共2个疗程,T组)和联合用药组(NM-3和紫杉醇剂量用法同单药组,NT组),移植后第十周末,停止用药,实验动物自由生长10天后处死,观察NM-3和紫杉醇在体内对胃癌生长和转移的影响;TUNEL方法检测胃癌细胞凋亡,免疫组化方法测定CD34的表达,计算微血管密度(MVD),并用免疫组化、实时定量荧光RT-PCR和Western blot等技术检测VEGF、bFGF、TGF-β1、bcl-2、p53、caspase3、survivin、smad3和smad4等的表达。结果:NM-3、植物提取药物紫杉醇及两者联合均可显著抑制SCID小鼠内原位移植人胃癌的生长,其抑瘤率分别为29.55%、25.12%和46.18%(P<0.01),N组和T组相比较无显著差异,但联合用药组较N组和T组均显著增加,具有统计学差异(P<0.05);各组间动物体重及实验前后体重变化均无显著性差异(P>0.05);N组、T组和NT组胃癌细胞的凋亡指数(AI)分别为25.62±6.46%、28.90±5.38%和38.51±5.14%,均较对照组13.24±7.75%显著增加(P<0.05或P<0.01),且NT组AI较N组和T均显著增加;对照组、NM-3组、紫杉醇组和联合组的胃癌转移率分别为100%、33.33%、83.33%和16.67%,统计学显示N组和NT组肿瘤转移率较对照组显著降低(P<0.05);NM-3组、紫杉醇组、联合用药组和对照组胃癌的微血管密度分别为6.47±0.92、7.67±1.02、4.07±0.77和11.07±0.92,前三组均较对照组显著降低(P<0.01);免疫组化显示对照组、N组、NT组的VEGF和bFGF的阳性率分别为100%、50%、33.3 %和83.3%、50%、33.3%,N组、NT组均较对照组显著降低(P<0.05或P<0.01);实时定量荧光RT-PCR则显示N组和NT组VEGF、bFGF和TGF-β1 mRNA的含量较对照组显著降低(VEGF CT值:15.04±1.12、16.88±1.37、10.59±0.82 ; bFGF CT值: 12.89±0.78、15.57±2.34、10.59±0.79;TGF-β1 CT值:17.31±1.04、18.44±1.06、13.92±1.07);而紫杉醇对VEGF、bFGF和TGF-β1 mRNA表达的表达均无影响。以GAPDH为内参,实时定量荧光RT-PCR检测p53和bcl-2 mRNA在N组、T组、NT组、对照组的表达,其结果分别为1.28±0.48%、2.11±0.57%、1.07±0.82%、6.07±0.94%和0.92±0.23%、2.35±0.84%、0.22±0.16%、5.23±1.96%,与对照组比较,NM-3、紫杉醇、NM-3联合紫杉醇均可显著抑制p53和bcl-2 mRNA的表达(P<0.01),而联合组与NM-3组相比无显著差异(P>0.05);Western blot检测显示N组、T组和NT组caspase3蛋白表达较对照组显著增加(88.64±11.91%、71.87±5.68%和119.44±9.78% vs 49.54±11.25%,P<0.01),且NT组与N组和T组之间相比,均有显著性差异(P<0.01);而N组、T组和NT组与对照组比较其survivin的表达均显著降低(76.31±9.14%、86.45±6.10%和57.87±3.86% vs 102.03±12.27%,P<0.05),且NT组与N组和T组之间相比,均有显著性差异(P<0.01)。Western blot检测还显示N组和NT组smad3和smad4蛋白的表达较对照组均显著增加(smad3:63.64±4.22%、81.91±12.11% vs 40.81±7.70%和smad4:73.78±12.82%、81.96±10.17% vs 46.16±12.59%,P<0.01),而紫杉醇对smad3和smad4的表达均无影响。结论:小剂量NM-3和植物提取的紫杉醇对SCID小鼠内原位移植人胃癌的生长均有显著的抑制作用,两者联合有协同作用并能显著减少胃癌的转移;NM-3对SCID鼠内胃癌的血管生成有显著的抑制作用,这与其在蛋白质和/或转录水平明显降低胃癌组织VEGF、bFGF和TGF-β1的表达有关,而且NM-3还能够显著增加TGF-β1信号传导通路中的smad3和smad4的表达,提示NM-3抗转移作用有可能与此有关;紫杉醇对SCID鼠内原位移植人胃癌的血管生成亦有一定的抑制作用,但它对VEGF、bFGF和TGF-β1等血管生成因子的表达无影响;NM-3联合紫杉醇对SCID鼠内原位移植人胃癌的微血管生成有协同抑制作用,这可能与两者具有不同的抗血管生成机理有关;NM-3和紫杉醇均可在体内通过抑制bcl-2、survivin和突变型p53的表达,同时增加活性caspase-3蛋白的表达从而诱导胃癌细胞的凋亡。
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