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[背景]胃肠动力障碍是糖尿病(diabetes mellitus,DM)常见的慢性并发症。该病发病机制尚未明了,既往研究认为:主要与Cajal间质细胞(intersitital cells of Cajal,ICC)病变、胃肠激素、平滑肌细胞(smooth muscle cells,SMCs)病变以及胃肠自主神经病变等因素有关。糖基化终末产物(Advanced glycation end products,AGE)是蛋白质和脂类非酶糖基化后生成的多炭糖的统称,在DM患者血清和各组织器官中的含量较正常人明显升高,糖基化终产物受体(Receptor for advanced glycation end products,RAGE)是AGE的特异性受体,能介导炎症、细胞凋亡、增殖和自噬等生物学反应。研究发现AGE/RAGE可以激活MAPK多种通路、诱导视网膜外周细胞和肾小球系膜细胞凋亡,在DM眼底病和DM肾病中起重要作用;其中P38和JNK MAPK通路与应激和凋亡有关。基于以上背景,本课题拟探讨DM大鼠结肠平滑肌细胞凋亡与结肠动力的关系,以及AGE作用下大鼠结肠SMCs细胞凋亡、及MAPK通路在AGE诱导的SMCs凋亡中的作用。[目的]1.探讨AGE在DM大鼠结肠平滑肌中的表达、对SMCs细胞凋亡的影响。2.探讨MAPK通路在AGE/RAGE介导的结肠SMCs凋亡中的作用。[方法]1、DM大鼠结肠(1)ELISA检测大鼠血清中CML(以此反映AGE)含量;Western Blot检测大鼠结肠平滑肌肌层中的CML含量。(2)TUNEL凋亡试剂盒检测大鼠结肠组织肌层的凋亡现象;Western Blot检测大鼠结肠肌层中的凋亡相关基因。2、原代结肠SMCs(1)不同浓度AGEs刺激大鼠结肠SMCs,检测SMCs细胞凋亡现象:①检测SMCs中Caspase 3活性;②检测SMCs中RAGE的表达。(2)不同浓度不同时间AGEs刺激SMCs,检测SMCs中凋亡蛋白的表达。(3)最佳浓度AGEs刺激SMCs,不同时间点检测SMCs中MAPK通路主要信号分子磷酸化的表达。(4)用干扰 RNA(Control siRNA 及 RAGE siRNA)转染细胞,检测 SMCs 中MAPK通路主要信号分子磷酸化的表达。[结果]1、DM大鼠结肠组织CML表达较正常对照组增多;DM组大鼠外周血中CML含量也明显高于正常对照组。2、DM组大鼠结肠SMCs凋亡数明显高于正常对照组。3、与正常对照组相比,DM大鼠结肠组织Caspase 3蛋白、Bax/Bcl 2比值升高。4、AGE干预后,结肠SMCs凋亡率、Caspase 3活性升高,并随着AGE浓度呈梯度上升。5、不同浓度、不同时间AGE对SMCs中Caspase 3表达的影响:AGE50、100、150、300 μ g/mL 组 Caspase 3/GAPDH 显著升高,AGE 300 μ g/mL 组 24、36、72小时Caspase 3/GAPDH显著升高,其中24小时蛋白表达最高。6、不同浓度AGE对SMCs中Bcl-2、Bax及RAGE表达的影响:AGE-BSA100、150、300μg/mL 组 RAGE 表达升高;AGE-BSA50、100、150、300μ g/mL 组Bax/Bcl-2水平升高。7、不同时间AGE对SMCs中MAPK通路表达的影响:AGE-BSA(300 μ g/mL)30、60min 组 p-P38 水平升高;AGE-BSA(300 μ g/mL)60min 组 p-JNK 水平升高。8、RAGE siRNA-AGE组P38和JNK蛋白磷酸化水平下降。[结论]1.DM大鼠血清和结肠组织中AGE表达增高,结肠肌层细胞凋亡明显。2.P38-MAPK和JNK-MAPK通路介导了 AGE/RAGE诱导的大鼠结肠SMCs凋亡。