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研究目的甲状腺相关眼病(thyroid associated ophthalmopathy,TAO)是弥漫性毒性甲状腺肿(Graves’disease,GD)最常见的甲状腺外表现,是累及眼眶的一种自身免疫性炎症性疾病。TAO具体发病机制十分复杂,至今仍不十分清楚,目前仍缺乏有效性治疗手段。目前证据表明眼眶成纤维细胞(orbital fibroblasts,OFs)在TAO发病机制中起核心作用,参与TAO眼眶炎症、组织重塑和纤维化等多种病理过程。骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)是一种分泌型磷酸化糖蛋白,在一些自身免疫性疾病中发挥重要作用,具有多种生物学效应,可诱导成纤维细胞增殖,并且和组织纤维化有密切关系,最近研究发现,GD患者血清中OPN水平明显增高。为了探究OPN和TAO发病的关系,首先拟检测TAO眼眶脂肪结缔组织中OPN mRNA和蛋白表达情况,相关细胞因子mRNA表达情况以及和OPN mRNA表达量之间的关系。然后进行细胞实验,用OPN刺激TAO患者来源OFs,观察OPN对OFs增殖、移行以及对VEGF和CollagenⅠmRNA表达量的影响并探究其相关机制。研究方法1.OPN在TAO患者眼眶脂肪结缔组织中的表达情况活动期或稳定期TAO患者行眼眶减压手术时,取眼眶脂肪结缔组织,用行眼整形手术患者的正常眼眶脂肪结缔组织作为对照组,每组6例。实时荧光定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)法和Western blotting法分别检测OPN mRNA和蛋白表达情况。然后通过RT-PCR检测相关细胞因子包括CD40L、CollagenⅠ、HAS2、NF-κB、CCL20、CD44、IFN-α和IFN-γmRNA表达情况,并和OPN mRNA表达量进行相关性分析。2.OPN对TAO患者OFs的影响及其作用机制探讨排除其它免疫性及炎症性疾病的TAO患者,行眼眶减压手术时,无菌条件下取眼眶脂肪结缔组织,组织块法培养OFs细胞。用OPN(5uM)进行预处理后,采用MTT法观察OFs增殖速率,并通过细胞划痕实验观察OPN对OFs移行的影响,再通过RT-PCR法检测OFs的VEGF和CollagenⅠmRNA表达量。同法培养OFs细胞,用PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002(20uM)、MAPK/ERK信号通路抑制剂PD98059(20uM)、LY294002和PD98059(20uM+20uM)以及OPN单克隆抗体1A12(20μg/ml)分别联合OPN对OFs进行预处理,通过MTT法、细胞划痕实验和RT-PCR法分别观察对OFs增殖、移行速率的影响,并检测OFs的VEGF和CollagenⅠmRNA表达量的变化。结果1.活动期TAO患者眼眶脂肪结缔组织OPN mRNA和蛋白表达量及相关细胞因子mRNA表达量升高活动期TAO患者组眼眶脂肪结缔组织中OPN mRNA比稳定期TAO患者组和正常对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);OPN蛋白表达量也明显增加,和稳定期TAO患者OPN蛋白表达量相比有统计学差异(P<0.05),但和正常对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。活动期TAO患者组眼眶脂肪结缔组织中CD40L、CollagenⅠmRNA表达量比稳定期TAO患者组和正常对照组高,存在统计学差异(P<0.05);HAS2 mRNA表达量也升高,但和稳定期TAO患者组和正常对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);活动期和稳定期TAO患者组CD44 mRNA表达量均低于正常对照(P<0.05)。TAO患者OPN mRNA表达量和CD40L、CD44、HAS2 mRNA表达量之间存在明显的线性相关关系(P<0.05)。2.OPN可促进OFs的增殖、移行速率,并增加VEGF和CollagenⅠmRNA表达量。经过OPN处理后,OFs增殖和移行速率加快,加入1A12和LY294002后,OFs增殖和移行速率变慢,而加入PD98059后对这些效应无明显影响。经OPN预处理后,OFs的VEGF和CollagenⅠmRNA表达量明显增加,加入1A12和LY294002后,VEGF和CollagenⅠmRNA表达量降低,加入PD98059后对两种基因mRNA表达量无明显影响。结论活动期TAO患者眼眶脂肪结缔组织OPN mRNA和蛋白表达水平明显升高,同时CD40L、CollagenⅠ和HAS2 mRNA表达量也增加,且CD40L、CD44、HAS2mRNA表达量和OPN mRNA表达量之间呈明显的线性相关关系。OPN可以通过PI3K/Akt信号通路促进OFs增殖和移行,刺激OFs高表达CollagenⅠ和VEGF mRNA,说明OPN可能在活动期TAO发病机制中发挥重要作用,通过PI3K/Akt信号通路,协同CD40L、HAS2活化OFs以促进眼眶炎症的发生发展以及眼眶组织重塑和纤维化。